豬水皰性口炎(VSV)*試劑盒(熒光-PCR法)

本試劑盒用一對(duì)豬水皰性口炎(VSV)特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對(duì)日豬水皰性口炎(VSV)核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃避光保存、運(yùn)輸、避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。

【適用儀器】

ABI系列、MJ系列、Roche系列、博日系列及其他熒光定量PCR檢測(cè)儀。
【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò)6個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用0℃冰壺。

豬水皰性口炎(VSV)*試劑盒(熒光-PCR法)【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

組織：取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿，勻漿后置入潔凈的1.5ml離心管中；
液體標(biāo)本：取適量標(biāo)本13000rpm離心2min，棄上清。
1.2 DNA提取

1) 對(duì)上述處理好的標(biāo)本加入40ul 核酸提取液，100℃恒溫處理10分鐘，13,000 rpm離心5分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管，-20℃保存；
2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)代檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1

管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照），體系配制如下表：

試劑

WSSV 反應(yīng)液

酶液

用量（樣本數(shù)為N）

20μl

1μl

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的DNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μl，加入相應(yīng)的

反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；

5. 結(jié)果分析判定

結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置基線（baseline）：一般情況下，對(duì)ABI 7500、7700等儀器設(shè)為6-15cycle，對(duì)PE5700設(shè)為3-15cycle,對(duì)MJ Research Option2設(shè)為6-12cycle。特殊情況可對(duì)基線適當(dāng)調(diào)整。
設(shè)置閾值（threshold）:以閾值線剛超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線（無(wú)規(guī)則的噪音線）的zui高點(diǎn)。
結(jié)果判斷
陽(yáng)性：檢測(cè)樣本Ct值小于等于35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期；
可疑：檢測(cè)樣本Ct值大于35.0且小于40.0，重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果Ct值仍小于40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，為陽(yáng)性，否則為陰性；
陰性：檢測(cè)不到樣本Ct值或Ct值為40。

試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。.

全能核酸酶在非常廣泛的條件下，都能保持很高的穩(wěn)定性和消化核酸的活性，這使其能夠與多種細(xì)胞裂解液，如RIPA，或含有多種離子和非離子型去污劑、還原劑的蛋白提取試劑等兼容。例如：>100mM的鹽酸胍會(huì)完全抑制Benzonase活性，1mM的EDTA會(huì)部分抑制Benzonase活性，5mM的EDTA會(huì)使活性喪失90%，1mM的PMSF則不會(huì)抑制核酸酶活性。 濃度<0.4%的Triton® X-100對(duì)核酸酶活性幾乎無(wú)影響，<0.4%的脫氧膽酸鈉使核酸酶可保持70%的活性，超過(guò)該臨界值之后核酸酶活性會(huì)急劇降低，1%的濃度會(huì)使活性喪失70%；0.05%的SDS對(duì)核酸酶活性幾乎無(wú)影響，而SDS濃度在0.1%-1%之間時(shí)，核酸酶在變性后活性會(huì)急劇降低，可通過(guò)增加核酸酶的量使活性得到補(bǔ)償。另外，核酸酶可耐受6M尿素，當(dāng)尿素達(dá)到7M時(shí)，核酸酶在變性后活性會(huì)急劇降低，亦可通過(guò)增加核酸酶的量