可保種型藍白T載體/KLANG
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可保種型藍白T載體-KLANG

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≥1

¥1160.00

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商品參數(shù)
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商品介紹
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是否進口
分類 分子生物學(xué)
貨號 KL60803-50
級別
含量 99%
產(chǎn)品規(guī)格 50 ng
品牌 康朗生物/KLANG
用途范圍 用于 DNA 提取、RNA 提取等后續(xù)實驗
特色服務(wù) 具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。
產(chǎn)品名稱 可保種型藍白T載體
是否危險化學(xué)品
商品介紹

可保種型藍白T載體

產(chǎn)品及特點 本產(chǎn)品(曾用名:一站式藍白 T 載體)是環(huán)狀的可以制備藍白 T 載體的質(zhì)粒 DNA。T 載體是克隆 PCR 擴增產(chǎn)物的必不可少的工具,但是由于市場上的各種T 載體質(zhì)量參差不齊,用戶很難購買到滿意的產(chǎn)品;同時購買的 T 載體為線性DNA,不能保種,必須反復(fù)購買,累計成本很高。為解決這一問題,基因特推出可保種型 T 載體,用戶只需要購買 Xcm I 內(nèi)切酶就可以自己制備高質(zhì)量的 T載體,隨用隨配,十分方便。

1. 一次購買,終身擁有。本產(chǎn)品提供制備 T 載體用的環(huán)形質(zhì)粒 DNA,可以象其他質(zhì)粒一樣保種并長期保存。

2. 隨用隨配,十分方便。用戶只需要提供 Xcm I 限制性內(nèi)切酶和基本分子生物學(xué)實驗條件,就可以自己制備 T 載體。整個過程只要兩天。

3. T 載體含 T 率為 100。本方法不是使用傳統(tǒng)的加尾法,而是使用 Xcm I 酶切法。質(zhì)粒的多克隆位點上預(yù)先插入了一段長為 1.3 Kb 的 Xcm I DNA 片段,經(jīng) Xcm I 酶切后回收得到的質(zhì)粒 DNA(T 載體)兩端自然全部帶有 T 突出,

比例遠遠高于用 Taq DNA 聚合酶加尾法和 TdT 加尾法得到的 T 載體。

4. 方便各種下游操作。用本產(chǎn)品得到的藍白 T 載體插入位點兩側(cè)有多種常見的酶切位點,便于后續(xù)克?。?Xcm I 位點在 Alpha 互補區(qū),可以使用藍白斑篩選重組子;兩邊還有 T7 和 SP6 RNA 聚合酶啟動子,便于制備 RNA 探針
規(guī)格及成分 成 份 編 號A 型塑料袋包裝B 型塑料袋包裝
藍白 T 載體(環(huán)狀) LM60803a 50 ng 50 ng
Xcm I (5U/uL) LM60803b 無 20 uL
Xcm I Buffer, 10X LM60803c 無 0.3 mL
使用手冊 60803sc 1 份 1 份

運輸及保存 低溫運輸,-20℃保存,有效期兩年

自備試劑 連接反應(yīng)試劑


使用方法 一. 細菌的轉(zhuǎn)化

1. 將100 μL感受態(tài)細胞于冰上解凍。注意:好使用end A1菌種(如DH1、

DH5、DH5?、JM109、XL1-Blue等。常用宿主細菌的基因型可以參考

《分子克隆手冊》等參考書)。因為這類細菌所含DNase少,制備T載體后,殘留的DNase對的T末端的破壞機會更小。

2. 取5-10 μL本產(chǎn)品加入到感受態(tài)細胞中,輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物。在冰上放置30分鐘。

3. 將管放入預(yù)加溫到42℃的水浴中,熱休克90秒。快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細胞冷卻1~2分鐘。

4. 每管中加900 μL LB培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)1小時。

5. 取100 μL培養(yǎng)液涂布到含Amp的LB瓊脂平板表面。

6. 將平板置于室溫直至液體被吸收。

7. 倒置平皿,于37℃培養(yǎng),12~16小時后可出現(xiàn)菌落。

二. 細菌的鑒定

1. 挑取單個菌落進行過夜細菌培養(yǎng)。

2. 按常規(guī)的方法進行質(zhì)粒小量制備。

3. 用Xcm I內(nèi)切酶按下面條件酶切提取的質(zhì)粒DNA,如果大規(guī)模酶切,需要

按比例增加各成分用量:

成分 使用量

Xcm I Buffer, 10X 5 uL

質(zhì)粒DNA <或= 2 ug

Xcm I 1 uL

超純水 加到50uL

 37℃保溫一小時, 65℃保溫20分鐘使酶失活。

4. 電泳,本產(chǎn)品被Xcm I酶切后將產(chǎn)生3 Kb和1.3 Kb的兩段DNA。

5. 如果Xcm I酶切圖譜正確,則按常規(guī)的方法進行細菌的保種(詳見分子克隆手冊等參考書)。

三. T載體的制備

1. 參考《分子克隆手冊》等參考書培養(yǎng)細菌和提取質(zhì)粒DNA。注意:一定要去盡可能去除殘留的RNA和蛋白質(zhì)(含殘留DNase)的污染。

2. 用Xcm I酶切質(zhì)粒。注意:酶切時間好不要超過一小時,避免殘留的DNase對T末端的破壞。

3. 電泳后切下含3Kb DNA(既藍白T載體)的膠段。注意:千萬不要用UV照射將要回收的片段,因為UV會使DNA交連,使DNA失去轉(zhuǎn)化細菌的能力。如果酶切的DNA量大,可以使用基因綠如藍核酸染料,可以直接在可見光和黑背景下切膠。如果別無選擇,好在長波(360nm)紫外燈下快速切膠,盡可能切掉多余的凝膠。為避免DNA交連,可以使用基因的DNA防護劑UV Erasol(CAT#:60601)

4. 用常規(guī)DNA回收方法進行膠回收。

5. 測定T載體DNA的濃度后,將T載體DNA保存在-20℃?zhèn)溆没蛑苯邮褂谩?/p>

四. 連接反應(yīng)

1. 短暫離心裝有T載體的離心管。

2. 在兩個離心管中加入下列成分:

成份 樣品管 陰性對照管

T4 Ligase Buffer,10X 1 uL 1 uL

藍白 T 載體 20-50 ng 20-50 ng

PCR 純化產(chǎn)物 50-500 ng 不加

T4 Ligase 3-5 U 3-5 U

補水到 10 uL 10 uL

注意: PCR純化產(chǎn)物與藍白T載體的摩爾比好為3:1-10:1。

3. 用移液器吹打連接反應(yīng)使之混勻后,16℃孵育12小時(或按T4 Ligase供貨商提供的操作手冊進行連接)。

五. 細菌轉(zhuǎn)化和鑒定

1. 取5 μL連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化,具體步驟見本手冊一,好使用含X-gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板以便進行藍白篩選。

2. 按經(jīng)典的質(zhì)粒提取+酶切或測序鑒定,可以選用的、在插入位點兩側(cè)都有酶切位點的酶有BstZ I、EcoR I和Not I。可以使用pUC/M13 Forward和Reverse測序引物測定插入片段的序列。按菌落PCR方法篩選,可選用基因的菌落PCR試劑盒(CAT#:50901)進行快速篩選,需要T7和SP6 RNA聚合酶啟動子引物。


聯(lián)系方式
公司名稱 上??道噬锟萍加邢薰?/span>
聯(lián)系賣家 蔡經(jīng)理 (QQ:3002763590)
電話 㜄㜇㜉-㜌㜉㜃㜃㜊㜇㜄㜊
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