DNA去磷酸化試劑盒

產(chǎn)品及特點 分子克隆時，載體的自連極大降低了連接效率，如果對載體 DNA 兩個 5′端的-PO4 基團進(jìn)行去磷酸化處理，則可以抑制自連反應(yīng)。此外在進(jìn)行 DNA 5′端標(biāo)記前，也需要將其本來的-PO4 基團去除以便加上標(biāo)記基團。本公司開發(fā)的 DNA 去磷酸化產(chǎn)品就是針對這一目的而開發(fā)。它具有下列特點：

1. 把 DNA 5′端的-PO4 基團變成-OH 基團，使其喪失連接能力。

2. 模板可以是單鏈 DNA，也可以是雙鏈 DNA，既可以是平末端，也可以是 5′端突出或 3′端突出的粘性末端。

3. 處理后的核酸純化后可以直接用于連接反應(yīng)和標(biāo)記反應(yīng)。

4. 本產(chǎn)品足夠 20 次 20μL 體系的去磷酸化實驗

5. 本產(chǎn)品僅供科研使用。
規(guī)格及成分成 份 編 號 塑料袋包裝
10×去磷酸緩沖液 130828a 50 μL（紫蓋）
堿性磷酸酶 130828b 10 μL（紅蓋）
超純水 100935 1 mL（藍(lán)蓋）
使用手冊 130828sc 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，有效期為 12 個月。

自備試劑 DNA 片段

使用方法 注意：dNTP 和 ATP 也是堿性磷酸酶的底物，所以如果 DNA 溶液中有 dNTP（比如 PCR 產(chǎn)物中）和 ATP，一定要先將其去除，否則它們會耗掉大量的堿性磷酸酶活性，降低 DNA 去磷酸化效率。

一、純化 DNA 片段的去磷酸化 

1、在微量離心管中配制下列反應(yīng)液（20μL）：

成 分 用 量

膠回收的 DNA 片段 1 pmol（相當(dāng)于 1ug 3Kb 的線狀質(zhì)粒）

10×去磷酸緩沖液 2 μL

堿性磷酸酶 0.5 μL

超純水到 20 μL

2、建議在 37℃反應(yīng) 30 分鐘（對平末端、5′端突出或 3′端突出的 DNA 片段均采用此保溫條件）。

3、65℃反應(yīng) 5 分鐘變性堿性磷酸酶。

4、DNA 片段可以直接用于連接。

二、限制性酶切反應(yīng)的同步去磷酸化

5、本堿性磷酸酶在幾乎所有限制性內(nèi)切酶的緩沖液中都有活性，所以可以按 1ug3Kb DNA 加 1μL 堿性磷酸酶的比例直接加到限制內(nèi)切酶的反應(yīng)液中（反應(yīng)液中不能含 dNTP 和 ATP）。

6、加熱滅活限制性內(nèi)切酶和堿性磷酸酶（滅活條件根據(jù)限制性內(nèi)切酶不同而不同，但不能低于 65℃，時間不能短于 5 分鐘，否則不能滅活堿性磷酸酶）。滅活后的樣品可以直接用于后續(xù)實驗。

7、如果不能采取加熱滅活限制性內(nèi)切酶和堿性磷酸酶，則需酚/氯仿抽提去除酶。具體操作如下(本試劑盒不提供相關(guān)試劑，需要從本公司另購相關(guān)試劑，下列操作僅供參考)：

附：酚/氯仿抽提去除酶步驟：

1、在反應(yīng)液中加入超純水使體積變成 100μL，以免純化過程中 DNA 丟失。如果有必須，可以加入和 4μL 核酸助沉劑提高回收效率。

2、加入 100μL 酚/氯仿/異戊醇 25：24：1 混合液震蕩半分鐘混勻，室溫 12000g離心 3 分鐘，轉(zhuǎn)移上清到新離心管中。

3、加 0.1 倍體積（即 10μL）的 3 M 乙酸鈉溶液（pH 5.2）。

4、再加入 2.5 倍體積（即 250μL）的無水乙醇。

5、混勻后 12000g 4℃離心 10 分鐘，小心棄上清。

6、加入 1mL 70%乙醇，短暫離心 3 分鐘后小心棄上清。

7、短暫離心 5 秒，吸棄殘留液體（約 30-50μL）。

8、室溫放置 2 分鐘干燥后加入適量的超純水溶解 DNA，立即使用或放-20℃長期保存。