超級(jí)雜交液（含甲酰胺）

產(chǎn)品及特點(diǎn)

 核酸雜交一般是指用一種標(biāo)記的核酸探針與印跡膜上的核酸進(jìn)行雜交，由此檢測(cè)印跡膜上是否存在與探針同源的核酸分子（靶分子）。核酸雜交是分子生物學(xué)的基本技術(shù)之一，應(yīng)用非常廣泛。由于核酸雜交效率受印跡膜種類、雜交溫度、探針濃度、雜交液離子強(qiáng)度、雜交液 pH 及雜交液粘度等因素影響，用戶自己摸索和優(yōu)化相關(guān)條件非常繁瑣，因此本公司開(kāi)發(fā)了本產(chǎn)品，它具有下列特點(diǎn)：

1. 既可用于 Southern 雜交（靶分子為 DNA），也可用于和 Northern 雜交（靶分子為 RNA），還可以用于菌落雜交，基因芯片等雜交。

2. 既可以用于同位素探針的雜交，也可以用于非同位素探針的雜交。

3. 既可以使用 DNA（包括 DNA Oligo）探針，也可以使用 RNA 探針（包括 RNA Oligo）

4. 含多種能夠促進(jìn)雜交的聚合物，使雜交反應(yīng)能在 6~12 小時(shí)完成，而常規(guī)雜交反應(yīng)一般需要 12~24 小時(shí)。

5. 含多種封堵劑，能阻印跡膜對(duì)探針?lè)肿拥姆翘禺愋晕剑苡行Ы档捅尘靶盘?hào)，延長(zhǎng)曝光時(shí)間以便檢測(cè)到低拷貝的 RNA（Northern）和單拷貝的基因（Southern）。

6. A 型不含甲酰胺，B 型含 50%的甲酰胺。后者使雜交在較低溫度就可以完成，適合 Tm 較高的分子雜交（如 RNA-RNA 和 RNA-DNA 雜交）。

7. 跟各種常用的印跡膜兼容，包括硝酸纖維素膜和尼龍膜。

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。本產(chǎn)品屬于高鹽溶液，低溫下產(chǎn)生沉淀，必須在 65℃加熱溶解并充分搖勻后才能使用。

自備試劑 印跡膜、標(biāo)記探針、6×SSC、2×SSC、0.1×SSC

使用方法 一、根據(jù)探針和靶分子的不同，分別按下面不同情況計(jì)算雜交分子的 Tm 值

1. 對(duì) DNA-DNA 雜交，其 Tm = 81.5 + 16.6×log10[Na+] + 0.41×GC%–500/L

說(shuō)明：L 是探針或靶分子的長(zhǎng)度（用兩者中最短的一個(gè)）GC%是探針或靶分子中的 GC 百分比（用兩者中最短的一個(gè)）Na+濃 度 是 本 產(chǎn) 品 中 Na+ 的 濃 度 ， 為 0.75 M， 16.6×log10[Na+]=（-2.07）

2. 對(duì) DNA-RNA 雜交，其 Tm 值比 DNA-DNA 的 Tm 值要高 10-15℃。

3. 對(duì) RNA-RNA 雜交，其 Tm 值比 DNA-DNA 的 Tm 值要高 20-25℃。

4. 對(duì) Oligo 探針雜交，Tm=GC 數(shù)量×4℃+AT 數(shù)量×2℃。

二、確定雜交溫度（預(yù)雜交溫度跟雜交溫度應(yīng)該一樣）

1. 對(duì)于大于 200bp 的 DNA-DNA 雜交，雜交溫度一般比 Tm 低15-25℃，一般選擇 68℃。

2. 對(duì) RNA-RNA 或 DNA-RNA 雜交，雜交溫度一般比 Tm 低15-25℃。如果這樣計(jì)算出的雜交溫度很高（如高于 70℃ ），則 RNA容易降解，所以選用含甲酰胺的超級(jí)雜交液（B 型本產(chǎn)品），以便能在 42℃完成雜交。

3. 對(duì) Oligo 探針的雜交，雜交溫度一般比 Tm 低 5℃。由于 Oligo較短，更容易受各種因素影響（如錯(cuò)配率、修飾堿基比例等），所以溫度需要適度摸索和優(yōu)化。

三、確定洗膜溫度

一般使用 0.1×SSC 做洗膜液，在此條件下的洗膜溫度比 Tm 低5-12℃，一般情況下可以在 55℃進(jìn)行洗膜。Oligo 探針可以室溫洗膜。

四、預(yù)雜交步驟

預(yù)雜交就是用不含探針的本產(chǎn)品跟印跡膜進(jìn)行孵育，其目的是用所含的非特異性 DNA 分子(鮭精 DNA 或小牛胸腺 DNA)及其它高分子化合物將印跡膜上會(huì)非特異地吸附探針?lè)肿拥奈稽c(diǎn)封閉，否則這些位點(diǎn)會(huì)吸附標(biāo)記的探針，造成高背景。

1. 將結(jié)合了靶分子的硝酸纖維素印跡膜或尼龍印跡膜浸泡于自備的 6×SSC 溶液中，使其充分濕潤(rùn)。

2. 將濕潤(rùn)的印跡膜置于一塑料雜交袋中（塑料袋預(yù)先封口，再剪掉一角，留一個(gè)小口），按每平方厘米印跡膜加 0.2 mL 超級(jí)雜交液的比例沿小口加入超級(jí)雜交液，然后用塑料封口機(jī)將口封牢。

3. 將此塑料袋浸沒(méi)入溫度設(shè)定在雜交溫度的恒溫水浴中或雜交爐中，保溫 1-2 小時(shí)，延長(zhǎng)到 12-16 小時(shí)亦可。注意保溫過(guò)程中塑料袋應(yīng)在不停的搖動(dòng)狀態(tài)中，使超級(jí)雜交液與印跡膜充分接觸。

五、雜交步驟

1. 如果標(biāo)記的探針是雙鏈核酸，則需經(jīng)變性處理。具體操作是將探針樣品在沸水浴中加熱 5 分鐘，然后迅速置冰浴中。如果是單鏈 DNA 或RNA 探針，則不需變性，直接使用。

2. 將單鏈探針或變性后的雙鏈探針加入到完成了預(yù)雜交的雜交袋中（先用剪刀剪一小口，加入探針后用熱封機(jī)封口）。探針的加入量視探針標(biāo)記效率而定，一般要求終濃度不能低于 1-2 ng/mL。如果檢測(cè)基因組中的單拷貝基因，探針的加入量應(yīng)加大，而對(duì)于檢測(cè)克隆的基因片段，則探針的量可減少。如果是放射性探針，應(yīng)將此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免雜交袋發(fā)生遺漏、污染工作環(huán)境。

3. 在選定的雜交溫度下繼續(xù)保溫，時(shí)間一般為 6-12 小時(shí)。

六、洗膜步驟。注意在下面的所有操作過(guò)程中，一定不要使印跡膜干燥。此步是將與印跡膜非特異結(jié)合的探針?lè)肿酉慈ザ涣粝绿禺惤Y(jié)合的探針?lè)肿?。由于非特異性雜交的雜交分子解鏈溫度較低，熱穩(wěn)定性較差，在一定的溫度和較低的離子強(qiáng)度下，即可洗掉。

1. 雜交完畢，取出塑料袋，剪去一角，倒出所有的含探針的雜交液。此含探針的雜交液可以多次使用再倒棄。

2. 剪開(kāi)雜交袋，用鑷子取出印跡膜，浸沒(méi)于大量的 2×SSC（含 0.5 %SDS）溶液中，室溫下振蕩漂洗 15 分鐘。

3. 重復(fù)上步操作一次。

4. 將印跡膜轉(zhuǎn)移至 0.1×SSC（含 0.1% SDS）溶液中，在計(jì)算好的洗膜溫度下振蕩漂洗 30 分鐘至 1 小時(shí)。

5. 重復(fù)上步操作一次。如果是同位素標(biāo)記探針，則需要重復(fù)至用蓋革計(jì)數(shù)器在無(wú)核酸區(qū)域檢測(cè)不出放射信號(hào)為止。

6. 將印跡膜轉(zhuǎn)移到濾紙上，吸去表面液體后印跡膜即可用于后續(xù)檢測(cè)。