DNA探針變性液

產品及特點雜交反應進行時，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈 DNA 探針 進行雜交（包括檢測 RNA 時），雙鏈 DNA 探針在雜交前必須進行變性。本 產品就是即用型的 DNA 探針變性液，專門針對 DNA 探針在雜交前進行變性 處理。本產品特點如下：

1. 即開即用。

2. 使用方便快捷，可用于核酸雜交。 
規(guī)格及成分 成份 編號 10 mL 塑料袋包裝
本產品 LM131208 10 mL
使用手冊 1 份

運輸及保存 常溫運輸和保存，有效期一年。

自備試劑 印跡膜、標記探針、6×SSC、2×SSC、0.1×SSC、超級雜交液、Tris-Cl 溶液（1 M，pH 7.2）、HCl 溶液（0.4 M）

使用方法一、根據(jù)探針和靶分子的不同，分別按下面不同情況計算雜交分子的 Tm 值

1. 對 DNA-DNA 雜交，其 Tm = 81.5 + 16.6×log10[Na+ ] + 0.41×GC% –500/L 說明：L 是探針或靶分子的長度（用兩者中最短的一個） GC%是探針或靶分子中的 GC 百分比（用兩者中最短的一個） Na+ 濃度是超級雜交液中 Na+ 的濃度，為 0.75 M，16.6×log10[Na+ ]= （-2.07） 2. 對 DNA-RNA 雜交，其 Tm 值比 DNA-DNA 的 Tm 值要高 10-15℃。 3. 對 RNA-RNA 雜交，其 Tm 值比 DNA-DNA 的 Tm 值要高 20-25℃。 4. 對 Oligo 探針雜交，Tm=GC 數(shù)量×4℃+AT 數(shù)量×2℃。

二、確定佳雜交溫度（預雜交溫度跟雜交溫度應該一樣）

1. 對于大于 200 bp 的 DNA-DNA 雜交，佳雜交溫度一般比 Tm 低 15-25℃，一般選擇 68℃。

2. 對 RNA-RNA 或 DNA-RNA 雜交，佳雜交溫度一般比 Tm 低 15-25℃。 如果這樣計算出的雜交溫度很高（如高于 70℃），則 RNA 容易降解，所 以好選用含甲酰胺的超級雜交液（超級雜交液 B 型），以便能在 42℃ 完成雜交。

3. 對 Oligo 探針的雜交，佳雜交溫度一般比 Tm 低 5℃。由于 Oligo 較短， 更容易受各種因素影響（如錯配率、修飾堿基比例等），所以佳溫度需 要適度摸索和優(yōu)化。

三、確定洗膜溫度

一般使用 0.1×SSC 做洗膜液，在此條件下的佳洗膜溫度比 Tm 低 5-12℃，一般情況下可以在 55℃進行洗膜。Oligo 探針可以室溫洗膜。

四、預雜交步驟

預雜交就是用不含探針的超級雜交液跟印跡膜進行孵育，其目的是用所含 的非特異性 DNA 分子(鮭精 DNA 或小牛胸腺 DNA)及其它高分子化合物將印 跡膜上會非特異地吸附探針分子的位點封閉，否則這些位點會吸附標記的探 針，造成高背景。 1. 將結合了靶分子的硝酸纖維素印跡膜或尼龍印跡膜浸泡于自備的 6× SSC 溶液中，使其充分濕潤。

2. 將濕潤的印跡膜置于一塑料雜交袋中（塑料袋好預先封口，再剪掉一角， 留一個小口），按每平方厘米印跡膜加 0.2 mL 超級雜交液的比例沿小口 加入超級雜交液，然后用塑料封口機將口封牢。

3. 將此塑料袋浸沒入溫度設定在佳雜交溫度的恒溫水浴中或雜交爐中，保 溫 1-2 小時，延長到 12-16 小時亦可。注意保溫過程中塑料袋應在不停 的搖動狀態(tài)中，使超級雜交液與印跡膜充分接觸。

五、雜交步驟

1. 如果標記的探針是雙鏈核酸，則需經(jīng)變性處理。具體操作是：根據(jù)探針濃 度和雜交所需探針的量計算出所需的探針體積，取出所需體積的探針到一 干凈的硅化的塑料離心管中，加入等體積的本產品，吹打混勻后室溫放置 5 分鐘變性后，將探針樣品放入冰浴中冷卻，加入 0.05 倍體積的自備的 1 M 的 Tris-Cl 溶液（pH 7.2）以及等體積的自備的 0.4 M 的 HCl 溶液。 將探針樣品保存在冰浴中直至需要。如果是單鏈 DNA 或 RNA 探針，則 不需變性，直接使用。

2. 將單鏈探針或變性后的雙鏈探針加入到完成了預雜交的雜交袋中（先用剪 刀剪一小口，加入探針后用熱封機封口）。探針的加入量視探針標記效率 而定，一般要求終濃度不能低于 1-2 ng/mL。如果檢測基因組中的單拷 貝基因，探針的加入量應加大，而對于檢測克隆的基因片段，則探針的量 可減少。如果是放射性探針，應將此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免 雜交袋發(fā)生遺漏、污染工作環(huán)境。

3. 在選定的雜交溫度下繼續(xù)保溫，時間一般為 6-12 小時。

六、洗膜步驟。注意在下面的所有操作過程中，一定不要使印跡膜干燥。 此步是將與印跡膜非特異結合的探針分子洗去而只留下特異結合的探針 分子。由于非特異性雜交的雜交分子解鏈溫度較低，熱穩(wěn)定性較差，在一定的 溫度和較低的離子強度下，即可洗掉。

1. 雜交完畢，取出塑料袋，剪去一角，倒出所有的含探針的雜交液。此含探 針的雜交液可以多次使用再倒棄。

2. 剪開雜交袋，用鑷子取出印跡膜，浸沒于大量的 2×SSC（含 0.5 % SDS） 溶液中，室溫下振蕩漂洗 15 分鐘。

3. 重復上步操作一次。

4. 將印跡膜轉移至 0.1×SSC（含 0.1% SDS）溶液中，在計算好的洗膜溫 度下振蕩漂洗 30 分鐘至 1 小時。

5. 重復上步操作一次。如果是同位素標記探針，則需要重復至用蓋革計數(shù)器 在無核酸區(qū)域檢測不出放射信號為止。

6. 將印跡膜轉移到濾紙上，吸去表面液體后印跡膜即可用于后續(xù)檢測。