柱式質(zhì)粒DNAout

產(chǎn)品及特點(diǎn) 本試劑盒是用于質(zhì)粒 DNA 小量制備與純化的試劑盒。本產(chǎn)品基于改良后的堿變性法，首先菌體經(jīng)堿裂解法處理使基因組 DNA 和質(zhì)粒 DNA 均變性，再用酸中和，質(zhì)粒 DNA 客戶快速復(fù)性，而基因組 DNA 不能快速復(fù)性，故可以通過離心去除，除去后含質(zhì)粒的上清用離心吸附柱吸附質(zhì)粒 DNA，洗去雜質(zhì)，即可得到純化的質(zhì)粒 DNA。本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：

1. 快速、步驟少，整個(gè)操作在 30 分鐘左右完成。

2. 不需要預(yù)平衡離心吸附柱。

3. 通用洗柱液即開即用，不需要用戶額外加乙醇。

4. 溶液 B 中有藍(lán)色染料，便于目測(cè)非常關(guān)鍵的堿變性和中和反應(yīng)兩步的溶液混勻狀況，保證實(shí)驗(yàn)效果。

5. 產(chǎn)量高，一次可以處理 1-4 mL 過夜培養(yǎng)的菌液，每毫升過夜培養(yǎng)的細(xì)菌可以提取到 2-5 ug/mL（取決于質(zhì)粒是高拷貝、中拷貝還是低拷貝）。

6. 純度高，采用本試劑盒提取的質(zhì)粒 OD 比值在 1.8-2.0 之間，可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、測(cè)序及 PCR 等。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 大紙盒包裝 
柱式質(zhì)粒 DNAout 溶液 A LM60205a 26 mL 柱式質(zhì)粒 DNAout 溶液 B LM60205b 26 mL 柱式質(zhì)粒 DNAout 溶液 C LM60205c 36 mL RNase A 溶液,10mg/mL 3160 0.6 mL 通用洗柱液 60408 50 mL×2 DNA 洗脫液 2.0 111205 10 mL 離心吸附柱 60911 50 套×2 使用手冊(cè) 60205sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存，RNase A 溶液需要-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 無

使用方法 

1. 從篩選平板上挑取單菌落至含抗生素的培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng) 12-16 小時(shí)（搖床轉(zhuǎn)速 200-300）。注意：建議使用 LB 培養(yǎng)基，營養(yǎng)更豐富的培養(yǎng)基會(huì)使菌體濃度過高，超過純化系統(tǒng)處理能力而降低 DNA 質(zhì)量。另外，延長培養(yǎng)時(shí)間會(huì)因細(xì)胞死亡、裂解而造成質(zhì)粒 DNA 濃度降低。

2. 用 1.5 mL 離心管收集 1-4 mL 過夜培養(yǎng)飽和菌液，室溫 12,000 rpm 離心 1分鐘，棄上清，再短暫離心，吸棄殘留液體。

3. 一次使用本試劑盒時(shí)，先將全部 RNase A 溶液全部加入到柱式質(zhì)粒 DNAout溶液 A（簡(jiǎn)稱溶液 A，下同）中，搖勻后再取用，未用完的溶液 A 放 4℃保存。

4. 加入 250 uL 溶液 A，用槍頭充分吹打使菌體重懸。注意：細(xì)胞未充分懸浮會(huì)影響后續(xù)堿變性，可以使用漩渦振蕩器混勻或使用槍頭吸頭吹打沉淀至完全混勻。

5. 加入 250 uL 柱式質(zhì)粒 DNAout 溶液 B（下面簡(jiǎn)稱溶液 B，如果溶液 B 在低溫放置產(chǎn)生沉淀，須 37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用），溫和反復(fù)顛倒混勻看到溶液的藍(lán)色變得均勻并且溶液變粘即可（一般需要顛倒 4-6 次），然后冰上放置不超過 5 分鐘。注意：冰上放置不要超過 5 分鐘，否則質(zhì)粒 DNA 會(huì)有堿損傷。千萬不要?jiǎng)×艺袷帲駝t基因組 DNA 斷裂產(chǎn)生的片段非常容易污染質(zhì)粒 DNA。溶液 B 用后需要將蓋擰緊存放，否則空氣中的二氧化碳會(huì)進(jìn)入溶液，形成碳酸，中和溶液 B 中的堿，降低其效率。如果溶液 B 顏色不是藍(lán)色，則表示變質(zhì)，應(yīng)該棄之不用并且速跟廠家聯(lián)系。

6. 加入 350 uL 冰上預(yù)冷的柱式質(zhì)粒 DNAout 溶液 C（下面簡(jiǎn)稱溶液 C），溫和反復(fù)顛倒直到溶液顏色變成無色（一般需要顛倒混勻 4-6 次）?；靹蚝罂梢姲咨恋砦锂a(chǎn)生，然后冰上放置至少 5 分鐘讓質(zhì)粒 DNA 復(fù)性。

7. 12,000 rpm 離心 3 分鐘，小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時(shí)的溶液比重較大，部分沉淀物懸浮在上清液中屬正常，吸取上清時(shí)避開漂浮的沉淀物即可。如果此步的離心在 4℃進(jìn)行，可減輕沉淀物漂浮。

8. 靜置 2 分鐘以讓質(zhì)粒 DNA 與離心吸附柱充分結(jié)合，保證靜置不少于 2 分鐘十分重要。

9. 室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘，棄收集管中的廢液。

10. 加入 500 uL 的通用洗柱液到離心吸附柱中，室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘，棄收集管中廢液。注意：通用洗柱液中含乙醇，每次用后需要將蓋擰緊存放，否則乙醇會(huì)揮發(fā)。

11. 重復(fù)上步 1 次。

12. 室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘，甩干殘留液體。此步不能省略，否則殘留乙醇會(huì)影響 DNA 的后續(xù)使用（如殘留乙醇使 DNA 溶液在電泳上樣時(shí)不能沉淀到加樣孔中）。

13. 將離心吸附柱置于一個(gè)新的 1.5 mL 塑料離心管（自備）中，加入 30-100 uL65-80℃預(yù)熱的 DNA 洗脫液 2.0，室溫放置 2 分鐘。常溫的 DNA 洗脫液 2.0也可以用于洗脫，但產(chǎn)量稍微有所降低。

14. 室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘，離心管底溶液即質(zhì)粒 DNA。

15. 由于基因的吸附柱結(jié)合 DNA 能力較強(qiáng)，如果再加適量 DNA 洗脫液 2.0 到離心吸附柱中，往往還能洗脫下很多質(zhì)粒 DNA（相當(dāng)于一次洗脫的 20-30%），但注意不要使用上步得到的 DNA 洗脫液 2.0 來洗脫。