柱式分枝桿菌DNAout

產(chǎn)品及特點(diǎn)

分枝桿菌屬（Mycobacterium）是極為古老的細(xì)菌，與人類的疾病相關(guān)的就有 25 種以上，包括引起結(jié)核病的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteria tuberculosis）。近年來(lái)由于多重耐藥性分枝桿菌的出現(xiàn)，分枝桿菌再次成為人們關(guān)心的細(xì)菌。PCR快速診斷是目前檢測(cè)分枝桿菌的主流方法，但由于此類細(xì)菌具有十分獨(dú)特的堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，快速提取其基因組 DNA 一直是十分棘手的技術(shù)問(wèn)題。本產(chǎn)品就是為解決這一問(wèn)題而開發(fā)，具有下列特點(diǎn)：

1. 操作簡(jiǎn)單，客戶不需要準(zhǔn)備額外的試劑。

2. PCR 檢測(cè)靈敏度一般在 10-100 CFU/mL 樣品。

3. 既可以使用培養(yǎng)的細(xì)菌，也可以使用痰液、精液、血液、腦脊液等樣品。

4. 價(jià)廉物美，與國(guó)外同類產(chǎn)品相比質(zhì)量相當(dāng)，但價(jià)格便宜。

5. 安全無(wú)毒，本試劑盒對(duì)人體無(wú)害，無(wú)腐蝕性和刺激性氣味。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 大紙盒包裝 
柱式分枝桿菌 DNA 提取溶液 A 70703a 7.5 mL 柱式分枝桿菌 DNA 提取溶液 B 70703b 15 mL 柱式分枝桿菌 DNA 提取溶液 C 70703c 30 mL 化痰液成分（干粉） 70703d 5 克（10mL 瓶） 離心吸附柱 60911 50 套 通用洗柱液 60408 50 mL DNA 洗脫液 2.0 111205 10 mL 使用手冊(cè) 70703sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸及保存，但化痰液成分（干粉）和柱式分枝桿菌 DNA 提取溶液 B 需要低溫運(yùn)輸、4℃保存，有效期一年。

自備試劑 TE 緩沖液，氯仿。

使用方法

注意：文獻(xiàn)報(bào)道部分分枝桿菌在 DNA 提取過(guò)程中還有形成菌落的能力，所以任何丟棄的溶液都必須按有傳染性的污染物品對(duì)待，并嚴(yán)格按有關(guān)要求進(jìn)行消毒處理。

一: 培養(yǎng)的分枝桿菌樣品的預(yù)處理

1. 刮取培養(yǎng)的分枝桿菌到 0.5 mL 自備 TE 緩沖液中。

2. 80℃放置 20 分鐘以殺滅細(xì)菌。

3. 3000 g 室溫離心 15 分鐘，棄上清。

4. 將細(xì)菌沉淀放-20℃冰箱備用或直接進(jìn)入細(xì)菌基因組 DNA 提取步驟。

二: 含分枝桿菌的痰液樣品的預(yù)處理

1. 將痰液樣品(0.5mL-2mL)加入到干凈的 10 mL 或 15 mL 塑料離心管中。

2. 加 2mL 的自備蒸餾水，在加入 100mg 化痰液干粉，充分混合均勻后室溫放置 15-30 分鐘。如果痰很濃，可以延長(zhǎng)保溫時(shí)間。

3. 3000 g 室溫離心 15 分鐘，棄上清。

4. 將細(xì)菌沉淀放-20℃冰箱備用或直接進(jìn)入細(xì)菌基因組 DNA 提取步驟。

三: 含分枝桿菌的血液樣品的預(yù)處理

1. 用自備紅細(xì)胞裂解液對(duì)血液進(jìn)行紅細(xì)胞裂解處理（可另購(gòu)本公司紅細(xì)胞裂解液產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào) 60403）。

2. 將得到的白細(xì)胞沉淀放-20℃或更低溫度放置 10 分鐘。

3. 迅速將得到的白細(xì)胞沉淀 100℃加熱 10 分鐘。

4. 上述處理將使大部分白細(xì)胞破裂，加入自備的 TE 到離心管體積的一半位置。此步使白細(xì)胞的 DNA 進(jìn)入緩沖液中。

5. 離心 5-10 分鐘沉淀細(xì)菌，離心速度取決于離心管的大小。如果樣品在 1.5 mL離心管，則可以 12000-15000 g 室溫離心。如果樣品在 10-15 mL 離心管，則 3000-5000 g 室溫離心。

6. 吸棄上清(含白細(xì)胞 DNA)，將所得細(xì)菌沉淀放-20℃冰箱備用或直接進(jìn)入細(xì)菌基因組 DNA 提取步驟。

四: 分枝桿菌菌基因組 DNA 的提取

1. 將 150 uL 65℃預(yù)熱過(guò)的柱式分枝桿菌 DNA 提取溶液 A 加到有分枝桿菌沉淀的螺旋蓋離心管中，充分震蕩混勻。

2. 將細(xì)菌和溶液 A 的混合物轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的 1.5 mL 塑料螺旋蓋離心管中。強(qiáng)烈建議不要使用壓蓋式塑料離心管，否則后面處理過(guò)程溶液容易漏出。

3. 加入 300 uL 柱式分枝桿菌 DNA 提取溶液 B 和 300 uL 自備氯仿，充分震蕩混勻。

4. -20℃放置直到液體凝固，一般需要 20-60 分鐘。過(guò)夜放置也可。也可以-20℃放置 5 分鐘直到液體凝固。

5. 放室溫融化后振蕩半分鐘。

6. 12000-15000 g 室溫離心 3-5 分鐘。

7. 小心轉(zhuǎn)移全部上清到一個(gè)新離心管中，加入等體積的柱式分枝桿菌 DNA 提取溶液 C，顛倒混勻。

8. 將液體轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，室溫放置 2 分鐘。

9. 12000-15000 g 室溫離心半分鐘，棄穿透液。

10. 加入 0.5 mL 通用洗柱液 12000-15000 g 室溫離心半分鐘，棄穿透液。

11. 重復(fù)上步的洗滌過(guò)程一次。

12. 短暫離心半分鐘。此步不要省略，否則殘留的洗柱液（含乙醇）將會(huì)影響 DNA電泳、酶切和 PCR 等反應(yīng)。

13. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入 30-100uL DNA 洗脫液 2.0，12000-15000 g 室溫離心半分鐘，所得溶液即基因組 DNA。

14. 直接取 5-10 uL 電泳檢測(cè) DNA，其余放冰箱備用或用于后續(xù)反應(yīng)。