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原位雜交技術(shù)基本原理

原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放6射性或非放6射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái)。

為顯示特定的核酸序列必須具備3個(gè)重要條件：組織、細(xì)胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補(bǔ)的核苷酸序列(即探針)、有與探針結(jié)合的標(biāo)記物。

多種探針標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)

基于地高3辛、生物素和熒光標(biāo)記分子的標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)是常見的原位雜交檢測(cè)方法。

熒光標(biāo)記檢測(cè)常為直接探針標(biāo)記方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上連接Fluorescein后進(jìn)行核酸標(biāo)記。由于標(biāo)記在核酸上的熒光分子必須經(jīng)受雜交和洗脫過程中的考驗(yàn)，以及熒光分子易于衰減，其檢測(cè)靈敏度受到一定的影響。但對(duì)熒光分子的直接檢測(cè)呈現(xiàn)的背景較低。

間接標(biāo)記的方法中應(yīng)用了報(bào)告分子標(biāo)記的探針，報(bào)告分子通過親和酶促的方法進(jìn)行顯色。常用的報(bào)告分子如地高6辛，生物素。結(jié)合地高6辛抗6體或鏈霉親和素上耦聯(lián)的酶系統(tǒng)進(jìn)行間接的底物反應(yīng)檢測(cè)。地高6辛標(biāo)記核酸的歷史可追溯到1987年，由于地高6辛是洋地黃的花和葉中特有的成分，檢測(cè)時(shí)使用的地高6辛抗6體不會(huì)結(jié)合于其他的生物分子。這是相較于生物素標(biāo)記系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。地高6辛抗6體上可耦聯(lián)堿性磷酸酶、過氧化酶，及熒光分子和膠體金等，根據(jù)不同的應(yīng)用需求，呈現(xiàn)高信噪比的核酸檢測(cè)結(jié)果。但需注意，由于引入了免6疫檢測(cè)反應(yīng)，在放大檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，應(yīng)注意樣品內(nèi)源性酶的滅活，以降低檢測(cè)背景。

通過不同標(biāo)記方法的聯(lián)合應(yīng)用，還可在同一樣本中實(shí)現(xiàn)染色體不同區(qū)域或細(xì)胞樣本中不同RNA序列的多重檢測(cè)。