饒氏無(wú)綠藻探針?lè)晒舛縋CR試劑盒
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饒氏無(wú)綠藻探針?lè)晒舛縋CR試劑盒
饒氏無(wú)綠藻探針?lè)晒舛縋CR試劑盒
饒氏無(wú)綠藻探針?lè)晒舛縋CR試劑盒
饒氏無(wú)綠藻探針?lè)晒舛縋CR試劑盒

饒氏無(wú)綠藻探針?lè)晒舛縋CR試劑盒

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主要組成成分 探針?lè)?qRT-PCR 緩沖液,探針?lè)?qRT-PCR 酶混合液,熒光 PCR 專用模板稀釋液,探針?lè)?qRT-PCR引物混合液,qRT-PCR 探針,探針?lè)?qRT-PCR陽(yáng)性對(duì)照(1×10E8 拷貝/μL),核酸釋釋劑,使用手冊(cè)
貨號(hào) KL15-37220
性狀 水劑
規(guī)格 50T
貯藏 -20℃保存
有效期 一年
貨期 現(xiàn)貨
價(jià)格 3490
產(chǎn)品及特點(diǎn) 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。
品牌 康朗生物/KALANG
商品介紹

饒氏無(wú)綠藻探針?lè)晒舛?/font>RT-PCR試劑盒

Prototheca zopfii 

產(chǎn)品及特點(diǎn) 

熒光定量PCR是在PCR體系中加入熒光化合物(熒光染料或熒光探針)。利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,使每個(gè)循環(huán)變得“可見(jiàn)”。本產(chǎn)品就是以探針?lè)晒舛?RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門檢測(cè)饒氏無(wú)綠藻的試劑盒。

產(chǎn)品名稱

方法

規(guī)格

價(jià)格

饒氏無(wú)綠藻LAMP試劑盒

LAMP

50

2490

饒氏無(wú)綠藻PCR試劑盒

PCR

50

1490

饒氏無(wú)綠藻染料法熒光定量PCR試劑盒

染料法

50

2490

饒氏無(wú)綠藻探針?lè)晒舛?font face="Calibri">PCR試劑盒

探針?lè)?/span>

50

3490

它具有下列特點(diǎn):

1. 即開(kāi)即用,用戶只需要提供樣品RNA模板。

2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化,靈敏性高。

3. 提供陽(yáng)性對(duì)照,便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高,引物是根據(jù)饒氏無(wú)綠藻高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 20μL 體系的探針?lè)晒舛?RT-PCR 反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

 

規(guī)格及成分

成分

編號(hào)

十孔盒包裝

探針?lè)?qRT-PCR 緩沖液

A

500μL(黃蓋)

探針?lè)?qRT-PCR 酶混合液

B

100μL(紅蓋)

熒光 PCR 專用模板稀釋液

C

1 mL(黃蓋)

饒氏無(wú)綠藻探針?lè)?qRT-PCR引物混合液

D

100 μL(白蓋)

饒氏無(wú)綠藻 qRT-PCR 探針

E

50 μL(棕色管)

饒氏無(wú)綠藻探針?lè)?qRT-PCR陽(yáng)性對(duì)照(1×10E8 拷貝/μL)

F

50 μL(黃蓋)

核酸釋釋劑(試用裝)

G

20 次(1mL,綠蓋)

使用手冊(cè)

H

一份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,-20℃保存,保存期限為12個(gè)月。

自備試劑 樣品 RNA。

使用方法

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例)。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,分別為 7,65,43,2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。

3. 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭,在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭,在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7. 如果有N個(gè)樣品,最好設(shè)置N+2個(gè)提取,多出的一個(gè)是PC(樣品制備陽(yáng)性對(duì)照),一個(gè)是 NC(樣品制備陰性對(duì)照)??梢杂?/font>10μL陽(yáng)性對(duì)照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。

8. 用自選方法純化樣品的RNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。也以選購(gòu)本公司的柱式病毒RNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送20次免RNA提取的核酸釋放劑試用裝,該釋放劑的裂解液可以直接作為RT-PCR模板,省略了RNA提取步驟。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)(20μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行)

9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個(gè)PCR 管,其中N+2個(gè)用于上步得到的 N+2個(gè)樣品,1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照(用水做模板),6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+4 個(gè)PCR管,其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用水做模板),1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照(用第4號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加):

 

成分

樣品管N+2個(gè)

RT-PCR陰性對(duì)照管

標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管

2-7 管)

探針?lè)?font face="Calibri">qPCR緩沖液

10 μL

10 μL

10 μL

探針?lè)?qPCR 酶混合液

2 μL

2 μL

2 μL

饒氏無(wú)綠藻qRT-PCR探針

1 μL

1 μL

1 μL

饒氏無(wú)綠藻探針qRT-PCR

引物混合液

2 μL

 2 μL

2 μL

待測(cè)樣品 RNA 模板

5 μL

--

--

超純水

--

5 μL

--

7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液(2-7 號(hào))

--

--

5 μL2號(hào)樣到2號(hào)管,3號(hào)樣到3 號(hào)管…)

11. 蓋上蓋子后上機(jī),按下面參數(shù)進(jìn)行 qRT-PCR

過(guò)程

溫度

時(shí)間

逆轉(zhuǎn)錄

50

30 min

預(yù)變性

94

10 min

qRT-PCR 反應(yīng)(40 個(gè)循環(huán))

94

15 sec

60

1 min(采集 FAM 通道的熒光信號(hào))

五、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),只判斷陽(yáng)性或陰性,則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),有典型擴(kuò)增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 35,則為陽(yáng)性。

六、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法:

常見(jiàn)問(wèn)題

可能原因

解決方法

 

 

陽(yáng)性對(duì)照、待測(cè)樣本均無(wú)條帶。

PCR反應(yīng)體系或反應(yīng)條件不合適。

使用梯度PCR摸索PCR反應(yīng)條件。

PCR試劑保存不當(dāng)失去活性。

2× PCR Mix應(yīng)保存于-20℃,使用時(shí)避免反復(fù)凍融。若使用頻繁,可在4℃短時(shí)間存放。

引物設(shè)計(jì)問(wèn)題。

嘗試重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢查。

 

 

 

 

 

 

陽(yáng)性對(duì)照有目的條帶,待測(cè)樣本無(wú)條帶或條帶弱。

不當(dāng)儲(chǔ)存或長(zhǎng)期儲(chǔ)存引起試劑活性喪失。

使用新鮮的試劑。

加入組織裂解液過(guò)量。

增大反應(yīng)體系,或減少裂解液的用量。

樣本裂解混合液保存不當(dāng)或保存時(shí)間過(guò)久,DNA基因組已經(jīng)降解。

裂解混合液液可在4℃保存2-3天,盡量使用新制備的裂解液混合液進(jìn)行PCR。

模板加入量不適合。

在反應(yīng)體系10-20%范圍內(nèi)優(yōu)化模板加入量。反應(yīng)效性能較差時(shí),可以降模板濃度調(diào)節(jié)到低于10%的范圍。

PCR循環(huán)數(shù)不足。

適當(dāng)增加PCR的循環(huán)數(shù),推薦在35-40循環(huán)為佳。因?yàn)槟0鍙?fù)雜,一般PCR反應(yīng)要比用純化的 DNA模板多5-10個(gè)循環(huán)為佳。

 

 

 

非特異性擴(kuò)增

PCR退火溫度太低,循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。

增加PCR退火溫度,降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。

PCR引物錯(cuò)配。

重新設(shè)計(jì)PCR引物。

配制PCR反應(yīng)體系時(shí)溫度太高或配制完成后放置時(shí)間太久。

PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行,配制完成后盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

 

 

 

陰性對(duì)照出現(xiàn)目的條帶

操作工具或試劑污染。

實(shí)驗(yàn)所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅菌。操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。

樣本間交叉污染。

每個(gè)取樣器只對(duì)一個(gè)樣本使用;或取完一個(gè)樣本后,將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中,反復(fù)涮洗,然后用干凈的紙巾擦干殘液。

 

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公司名稱 上海康朗生物科技有限公司
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