名稱 PhyZol? Total RNA Extraction Reagent

規(guī)格 

PH1420-50 | 50mL

PH1420-100 | 100mL

存儲 

Store@4℃ 避光，12個月有效。

產(chǎn)品簡介 

PhyZol?是Phygene自主研發(fā)和生產(chǎn)的用于細(xì)胞或組織的總RNA提取試劑。PhyZol?采用與Invitrogen TRIzol完全相似的原理和方法，PhyZol?顏色、抽提的方法和步驟亦與Invitrogen TRIzol完全相同。PhyZol?含酚和異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速裂解細(xì)胞或組織并且滅活核酸酶，保持RNA的完整性。加入氯仿并離心后，溶液形成上清層為水相(無色)、中間層、下層為有機相(紅色)。上清層用異丙醇沉淀回收總RNA，中間層用乙醇沉淀回收DNA，下層用異丙醇沉淀回收蛋白。

Phygene的PhyZol?總RNA提取試劑適用于從各種組織或細(xì)胞中快速分離總RNA，既可用于小量樣品(50～100 mg組織、5×106細(xì)胞)，也可用于大量樣品(>1g組織/>107細(xì)胞)。提取的總RNA質(zhì)量高，可用于Northern blot、Dot blot、polyA篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆。

PhyZol?具有以下特點：

①適用范圍廣；

②操作簡單，整個過程1小時內(nèi)完成；

③純度高；

④污染少。

自備材料：

1、試劑：無水乙醇、氯仿、異丙醇、DEPC處理水等。

2、耗材： RNase廣泛存在于人的皮膚上和體液及環(huán)境中，RNase是導(dǎo)致RNA降解的最主要物質(zhì)，非常穩(wěn)定。操作時應(yīng)佩戴一次性口罩、手套、帽子。塑料制品、玻璃和金屬物品、實驗儀器等應(yīng)RNase，移液器吸頭、EP管等制品的RNase free處理尤為重要。

3、儀器：低溫高速離心機、低溫冰箱。

使用說明 

操作步驟(僅供參考)：

1、樣品準(zhǔn)備

①貼壁細(xì)胞：接裂解：直接在培養(yǎng)瓶/皿中加入PhyZol?裂解細(xì)胞，每10cm2面積加1ml PhyZol?，用移液器吹打混勻。

胰蛋白酶消化：用無菌PBS洗滌細(xì)胞后，加入含有0.05～0.25%胰蛋白酶的PBS處理細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞脫離容器壁后，加入含有血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至無RNase的離心管中，5000～6000g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，去除上清。收集細(xì)胞時一定要將細(xì)胞培養(yǎng)液去除干凈，否則裂解不完全，降低RNA收獲率。

②懸浮細(xì)胞：無需清洗細(xì)胞，直接5000～6000 g離心5 min，收集細(xì)胞。每5×106～107動物、植物和酵母細(xì)胞或每107細(xì)胞加入1ml PhyZol?。

③組織：取新鮮動物或者植物組織或者-70℃凍存組織，50～100mg組織在液氮中充分研磨或者加入1ml PhyZol?研磨或者用勻漿器勻漿處理。樣品體積一般不超過PhyZol?體積的10%。研磨要迅速，以1min為佳。

④血液：取0.5～1 ml新鮮或凍存的血液，12000g離心5 min，去除血漿，加入1ml PhyZol?，充分振蕩混勻。

2、核酸分離：充分振蕩混勻(可以置于低溫/超低溫冰箱凍存5～10 min后，充分振蕩，反復(fù)1～3次)，將裂解樣品或勻漿液室溫放置5～10 min，使核蛋白與核酸完全分離。

3、樣品分層：加入0.2 ml氯仿/1ml PhyZol?，劇烈振蕩15 s，室溫放置2～3 min。置于4℃離心機，12000 g離心10～15 min。上層為水相，中間層和下層為有機相，RNA在上層水相。

4、沉淀RNA：吸取上層水相(約500μl)轉(zhuǎn)移至無RNase的離心管中(不要吸取任何中間層物質(zhì),否則會有染色體DNA污染)，加入等體積異丙醇混勻，室溫放置15～20 min。12000 g 4℃離心10 min，離心后管側(cè)或管底形成膠狀沉淀，棄上清。

5、洗滌RNA：加入1ml DEPC水配制的75%乙醇/1ml PhyZol?洗滌沉淀，室溫放置5～10 min，7500g 4℃離心5 min，棄上清。室溫干燥5～10 min，不宜過分干燥，否則RNA難以溶解。

6、溶解RNA：加入30～50ul RNase-free ddH2O充分溶解RNA，-70℃長期保存或直接用于后續(xù)試驗。對于肝、胰腺、腎等組織中RNase含量高的樣品，沉淀時用100%去離子甲酰胺溶解。

分析與定量：

1、測定樣品在260 nm和280 nm的吸收值確定RNA的質(zhì)量。按1OD=40pg RNA計算RNA的產(chǎn)率。OD260/280在1.8～2.2視為抽提RNA純度較好。濃度在4μg/ml以上的樣品適于用分光光度計測定。

2、進行甲醛變性瓊脂糖電泳，確定RNA的完整性和污染情況。

3、核酸分析儀測定RNA的質(zhì)量和純度。

應(yīng)用舉例 

分別利用本品PhyZol?和Trizol從膠質(zhì)細(xì)胞中提取Total RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所提取RNA具有較好完整性， OD值均＞1.9。

注意事項 

1、樣品保存：加入PhyZol?混勻后，樣品可在-70℃放置1～2月；RNA樣品可以在70%酒精中-70℃保存2～4周：如果需要長期保存，應(yīng)置于超低溫冰箱中保存。

2、PhyZol?是強腐蝕性物質(zhì)，污染皮膚或眼睛后，立即用清水或生理鹽水沖洗，必要時尋求醫(yī)生的幫助。

3、PhyZol?可常溫運輸，建議保存4℃保存。

4、為了您的和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。 

常見問題         可能原因

A260/ A280＜1.6   抽提得到的RNA沉淀未完全溶解。

                        水相中混有有機相，從而存在蛋白質(zhì)和DNA污染。

                        RNA樣品用水而不是TE溶解。低離子濃度和低pH條件下，A280值會偏高。

                        樣品勻漿時加的PhyZol?試劑太少，RNA與蛋白質(zhì)、DNA未能完全分離。

                        勻漿后樣品未在室溫放置或者放置時間太短，RNA與核蛋白未完全解離。

DNA污染          樣品中含組織溶劑(如乙醇等)或堿性溶液，致水相減少或pH升高。

                        樣品勻漿時加入的試劑體積太少。如果存在DNA污染，可用DNA劑去除。

                        水相中混有有機相，從而存在蛋白質(zhì)和DNA污染。

RNA產(chǎn)量低          樣品裂解或勻漿處理不徹底，RNA沒有被完全釋放出來。

                        得到的RNA沉淀未完全溶解。

                        抽提的RNA中含有RNase。

RNA降解           組織或細(xì)胞不新鮮，樣品沒有及時被液氮凍存，導(dǎo)致組織或細(xì)胞中的RNA降解。

                        溶液或離心管未經(jīng)RNase free處理，RNase的污染導(dǎo)致RNA被降解。

                        細(xì)胞在胰蛋白酶消化時間過長，導(dǎo)致未加PhyZol?前RNA已經(jīng)部分降解。

                        電泳時使用的甲酰胺pH小于3.5，導(dǎo)致RNA發(fā)生酸解。

蛋白和多糖污染         水相中混有有機相，從而帶有蛋白質(zhì)和DNA。

                        樣品中蛋白、多糖含量高或樣品量太大，細(xì)胞未裂解完全。

*Important Note: This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications.