PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

血管內(nèi)皮生長因子C(VEGFC)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Phospho-SHP-2 (Tyr542) Antibody20 ul

激肽釋放酶3(KLK3)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Phospho-SHP-2 (Tyr542) Antibody100 ul

甲胎蛋白(αFP)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)SHP-2 Antibody100 ul

糖抗原15-3(CA15-3)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)JunB (C37F9) Rabbit mAb100 ul

糖抗原19-9(CA19-9)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)JunB (P169) Antibody100 ul

血小板因子4(PF4)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)hnRNP L Antibody100 ul

血小板因子4(PF4)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Myc-Tag (9B11) Mouse mAb (Alexa Fluor? 555 Conjugate)100 ul

糖化血紅蛋白(HbA1C)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)SNIP/p140Cap Antibody100 ul
尤氏泰勒蟲探針法熒光定量PCR試劑盒4-羥基香豆素(>98%,BR)7.813-500pg/mlVEGF-C(vascular endothelial growth factor C )|Flt4 ligand|Flt4-L|Vascular endothelial growth factor-related protein|VRPFLT4 ligand DHM

4-碘苯甲酸(>98%,BR)15.625-1000pg/mlVEGF-D(Vascular Endothelial Cell Growth Factor D)|FIGF|c-fos induced growth factor|vascular endothelial growth factor D

對碘甲苯(>98.5%,BR)0.156-10ng/mlVEGFR2|KDR|VEGFR|VEGFR-2|CD309|Flk-1|CD309 對甲氧基苯乙酮(>98%,BR)0.156-4-甲氧基酚(>98%,BR)7.813-500pg/mlVIP(vasoactive intestinal peptide)|VIP peptides|PHM27

對甲基肉桂酸(>98%,BR)31.25-2000pg/mlVLDL(Very low-density lipoprotein)

4-甲基傘形酯-N-乙酰-b-D-氨基半乳糖苷(>98%,BR)6.25-400ng/mlα1-AGP|ORM1|AGP|AGP1|AGPA|ORM1|Orosomucoid|AGP 1|AGP1|alpha-1-acid glycoprotein 1|AGP-A|OMD 1|ORM|orosomucoid 1|Orosomucoid-1|orosomucoid-1

4-硝基苯甲醛(>98%,BR)6.25-400ng/mlα1-MG|AMBP|A1M|EDC1|HCP|HI30|IATIL|ITI|ITIL|ITILC|UTI|A1M|alpha-1-microglobulin|bikunin precursor|bikunin|HCPcomplex-forming glycoprotein heterogeneous in charge|inter-alpha-trypsin inhibitor light chain|ITILgrowth-inhibiting protein 19|protein AMBP|protein HC|trypstatin|uristatin|uronic-acid-rich protein

對硝基芐醇(>98%,BR)93.75-6000pg/mlα-CTx

4-硝基溴化芐(>98%,BC)37.5-2400pg/mlα-GST

4-硝基芐氯(>98%,BR)0.313-20ng/mlβ-actin|ACTB|actin|beta|actin|cytoplasmic 1|beta cytoskeletal actin|Beta-actin|PS1TP5-binding protein 1|PS1TP5BP1

硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脫氧-b-D-葡萄糖苷(>99%,BC)125-8000pg/mlβ-CTx

4-硝基苯-Α-L-吡喃海藻糖苷(>98%,BC)15.625-1000pg/mlβ-EP(Beta-Endorphin)

4-硝基苯基-beta-D-葡萄糖醛酸苷(>98%,BC)31.25-2000pg/mlβ-EPR

4-硝基苯肼(>98%,BC)0.313-20ng/mlβ-Hex A|HEXA|TSD|beta-hexosaminidase subunit alpha|Beta-N-acetylhexosaminidase subunit alpha|hexosaminidase A(alpha polypeptide)|Hexosaminidase subunit A|N-acetyl-beta-glucosaminidase subunit alpha

98%500g1g712111090000/20200μlMicroPette手動單道可調(diào)式移液器(Dragonmed)Endostatin

 氨肉湯/Arginine Broth Acc.To Schubert游泳池中假單胞菌檢測250克國產(chǎn)/進(jìn)口

對照品塞來昔布相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人膜聯(lián)蛋白-A2(Anxa2)CLIA試劑盒 0.2ml

Human Receptor for advanced glycation end products, RAGE/AGER ELISA Kit  人晚期糖基化終末產(chǎn)物受體CAS號：5＇羥基哚脂肪酶檢測試盒500UHuman/人Elisa試盒326909

98%25g5g712111080000/10100μlMicroPette手動單道可調(diào)式移液器(Dragonmed)Endothelial nitric oxide synthase

糖化酶;葡萄糖淀粉酶 質(zhì)量規(guī)格：BR,10萬u/G Glucozyme

對照品塞來昔布相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人抗頂體蛋白抗體(ACR)CLIA試劑盒 0.2ml

人促性腺激素釋放激素(GnRH) RNF86  環(huán)指蛋白86規(guī)格:96T/48T規(guī)格:50mg膽堿酯酶檢測試盒20mg大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞1x10^6cells

98%500g1g變旋酶Leishimaria IgG antibody

鹽帕他莫(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：HPLC>99%,標(biāo)準(zhǔn)品 Propacetamol HCl 平菇 Pleurotus ostreatus戊糖桿菌 Lactobacillus pentosus

Iodine(Potassium Iodide Mixed Solution)胃癌抗原MG7檢測試盒20mg果糖胺檢測試盒GlycatedAlbumin

98%25g25g溶壁微球細(xì)胞Nitro reductase

羥基芍藥苷，氧化芍藥苷 訂購|咨詢 規(guī)格： 20mg 細(xì)胞粘附分子2抗體 EPP ELISA Kit 原卟啉(EPP)ELISA試劑盒

Ceftazidime添加于100mlHB4155凝血子I檢測試盒20mg糖化白蛋白檢測試盒CollagenTypeⅡ

95%100g100g麥芽化酶Caveolin 1

疊-赤-鞘氨醇 質(zhì)量規(guī)格：國進(jìn)口 Azido-erythro-sphingosine RN-h, 大鼠海馬趾神經(jīng)元

50% EggYolk Solution卵黃化鈉瓊脂或卵黃瓊脂或甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂的配套試凝血子III檢測試盒20mgⅡ型膠原蛋白檢測試盒proteoglycan
實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。