熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

骨保護(hù)素(OPG)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)NF-κB2 p100/p52 (D7A9K) Rabbit mAb100 ul

抑瘤素M(OSM)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)MCM7 (D10A11) XP? Rabbit mAb20 ul

白介素12(IL12)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)MCM7 (D10A11) XP? Rabbit mAb100 ul

調(diào)節(jié)激活正常T-細(xì)胞表達(dá)分泌因子(RANTES)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)TNF-R1 (C25C1) Rabbit mAb20 ul

調(diào)節(jié)激活正常T-細(xì)胞表達(dá)分泌因子(RANTES)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)TNF-R1 (C25C1) Rabbit mAb100 ul

干細(xì)胞因子(SCF)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)PHF8 (E9R4F) Rabbit mAb100 ul

干細(xì)胞因子(SCF)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)SUZ12 (D39F6) XP? Rabbit mAb20 ul

干細(xì)胞因子受體(SCFR)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)SUZ12 (D39F6) XP? Rabbit mAb100 ul
小泰勒蟲探針法熒光定量PCR試劑盒2-金剛烷酮(>99%,BR)0.156-10ng/mlVCAM-1|CD106|sVCAM-1|CD106 antigen|INCAM-100|L1CAM|vascular cell adhesion molecule 1|vascular cell adhesion protein 1|V-CAM 1|VCAM1

2-氨基-3-氯苯甲酸(>98%,BR)125-8000pg/mlTACR1|SPR|TAC1R|NK-1R|NK1Rneurokinin 1 receptor|NKIR|SPRsubstance-P receptor|TAC1Rtachykinin 1 receptor(substance P receptor|neurokinin 1 receptor)|tachykinin receptor 1(substance P receptor|neurokinin-1 receptor)|tachykinin receptor 1NK-1 receptor

2-溴丁酸(>98%,BR)0.156-10ng/mlTACR2

2-溴代萘1.563-100ng/mlTAFI|CPB2|CPU|carboxypeptidase B2|carboxypeptidase B2(plasma)|carboxypeptidase B2(plasma|carboxypeptidase U)|Carboxypeptidase U|PCPB|pCPB|Plasma carboxypeptidase B|TAFIcarboxypeptidase B-like protein|Thrombin-activable fibrinolysis inhibitor|thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor

2-溴丙酸(>99%,BR)156.25-10000pg/mlTAP

5-硝基-2-氯苯甲醛(>98%,BR)31.25-2000pg/mlTARC|CCL17(C-C motif chemokine 17)|TARC|ABCD-2|SCYA17|CC chemokine TARC|chemokine(C-C motif) ligand 17|SCYA17MGC138271|small inducible cytokine subfamily A(Cys-Cys)|member 17|Small-inducible cytokine A17|T cell-directed CC chemokine|TARCA-152E5.3|Thymus and activation-regulated chemokine

2-氯乙酰胺(>98.5%,BR)15.625-1000pg/mlTAT(Thrombin|Antithrombin Complex)|TATC

2-氯苯胺(>98%,BR)78.125-5000pg/mlTDGF1|CFC-2|TDGF1|TDGF-1|CR|Cripto-1|Cripto-1 growth factor|CRIPTO|CRGF|Epidermal growth factor-like cripto protein CR1|teratocarcinoma-derived growth factor 1

2-氯乙基磺酸鈉(>98%,BR)31.25-2000pg/mlTECK|CCL25|C-C motif chemokine 25|chemokine(C-C motif) ligand 25|Chemokine TECK|Ck beta-15|Ckb15|SCYA25TECKvar|small inducible cytokine subfamily A(Cys-Cys)|member 25|Small-inducible cytokine A25|TECKMGC150327|Thymus-expressed chemokine

2'-脫氧肌酐-5'-磷酸鈉(>98%,BR)0.313-20ng/mlTek|CD202b|TEK|angiopoietin-1 receptor|CD202B|CD202b antigen|hTIE2|p140 TEK|soluble TIE2 variant 1|soluble TIE2 variant 2|TEK tyrosine kinase|endothelial|TIE-2|TIE2CD202b|Tunica interna endothelial cell kinase|Tyrosine-protein kinase receptor TEK|Tyrosine-protein kinase receptor TIE-2|venous malformations|multiple cutaneous and mucosal

鄰乙氧基苯甲醛(>98%,BR)31.25-2000pg/mlTF(Tissue factor)|F3|FIII|CD142|TFA|Thromboplastin|Coagulation Factor III

鄰乙氧基苯甲酸(>98%,BR)62.5-4000pg/mlTFF2|SML1|SP|Spasmolysin|Spasmolytic Polypeptide|SML1trefoil factor 2|SML1|human spasmolytic polypeptide(SP)10spasmolytic protein 1|SP|spasmolysin|Spasmolysin|Spasmolytic polypeptide|trefoil factor 2

2-乙基丁酸(>99%,BR)62.5-4000pg/mlTFPI|EPI|LACI|convertin|EPITFPI1LACITFI|Extrinsic pathway inhibitor|Lipoprotein-associated coagulation inhibitor|tissue factor pathway inhibitor|tissue factor pathway inhibitor(lipoprotein-associated coagulation inhibitor)

鄰羥基苯乙酮(>99%,BR)0.313-20ng/mlTFR|CD71|TFRC|TFR1|TRFR|CD71 antigen|CD71TRFR|p90|T9|TfR|TfR1|TR|transferrin receptor(p90|CD71)|transferrin receptor protein 1|Trfr|

2-羥基苯乙酸(>98%,BR)31.25-2000pg/mlTGF-β1(Transforming Growth Factor Beta 1)|TGF-B1|TGFB|TGFbeta|CED|DPD1|TGFβ1

對(duì)照品胃泌素細(xì)胞抗體檢測(cè)試劑盒20mg

 淋巴瘤英文名稱：MJ（懸?。?/span>

基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP10)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 RRM1 蛋白 (His & GST 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)1.10582.0500

人疊氮胸苷(AZT) TRIM7/RNF90  糖原生成素相互作用蛋白抗體規(guī)格:96T/48TbetaChlorogenin規(guī)格:400mg膽固醇檢測(cè)試盒20mg大鼠纖維環(huán)細(xì)胞1x10^6cells

99%100g1g713112040000/0.510μlMicroPette Plus 全消毒手動(dòng)8道可調(diào)式移液器(Dragonmed)Visfatin

化鈣二水 質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR Calcium chloride, dihydrate

基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 HNRNPR / HNRNP-R / HNRNP R 蛋白 (His & GST 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷1.09207.0500

人抵抗素(Resistin)TRIM6/RNF89  環(huán)指蛋白89規(guī)格:96T/48T規(guī)格:500mg膽固醇酯檢測(cè)試盒20mg大鼠小腸成纖維細(xì)胞1x10^6cells

DiIC1(5)化物20mg

赤蘚紅B(>95.0%(E)) 質(zhì)量規(guī)格：>95.0%(E) Erythrosine B

高端化學(xué), 蒽醌

DiIC18(5)DS 20mg

地塞米松鈉 質(zhì)量規(guī)格：>98%,USP Dexamethasone Sodium Phosphate 大鼠腎小管平滑肌細(xì)胞完全培養(yǎng)基100mL

高端化學(xué), 縮二脲

DiIC18(3)DS20mg

L-甲狀腺素鈉鹽五水化合物 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR L-Thyroxine Sodium Salt Pentahydrate 豇豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium vigna異常漢遜酵母 Hansenula anomala

高端化學(xué), 四氧嘧啶