定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)p115 RhoGEF (D25D2) XP? Rabbit mAb100 ul

雙調(diào)蛋白(AREG)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)GFAP (GA5) Mouse mAb20 ul

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)GFAP (GA5) Mouse mAb300 ul

骨成型蛋白4(BMP4)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Phospho-Myosin Light Chain 2 (Ser19) Antibody100 ul

上皮性鈣黏附蛋白(CDHE)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Phospho-Myosin Light Chain 2 (Ser19) Antibody20 ul

睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Phospho-Myosin Light Chain 2 (Ser19) Antibody100 ul

紅細(xì)胞生成素(EPO)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Myosin Light Chain 2 Antibody100 ul

紅細(xì)胞生成素(EPO)檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Kindlin-1 (D1K4C) Rabbit mAb100 ul
RT-抗亞碲酸鹽大腸桿菌157:7型探針法熒光定量PCR試劑盒硫酸銫(分子生物學(xué)級(jí))15.625-1000pg/mlMIP-3β|CCL19|MIP-3 beta|beta chemokine exodus-3|Beta-chemokine exodus-3|CC chemokine ligand 19|C-C motif chemokine 19|chemokine(C-C motif) ligand 19|CKb11|EBI1-ligand chemokine|ELCMIP-3-beta|Epstein-Barr virus-induced molecule 1 ligand chemokine|exodus-3|Macrophage inflammatory protein 3 beta|macrophage inflammatory protein 3-beta|MGC34433|MIP-3b|MIP3BCK beta-11|SCYA19EBI1 ligand chemokine|small inducible cytokine subfamily A(Cys-Cys)|member 19|Small-inducible cytokine A19

銅片0.156-10ng/mlCXCL9|Miγ|MIG|CMK|crg-10|C-X-C motif chemokine 9|Gamma-interferon-induced monokine|Humig|HuMIG|MIGSmall-inducible cytokine B9|monokine induced by gamma interferon

氯化亞銅(>97%,BR)15.625-1000pg/mlMMP-1(Matrix Metalloproteinase 1)|CLGmatrix metalloprotease 1|CLGN|Fibroblast collagenase|interstitial collagenase|Matrix metalloproteinase-1

碘化亞銅(>99%,BR)0.156-10ng/mlMMP-10|MMP10|SL-2|STMY2|Stromelysin-2|Transin-2

2'-脫氧鳥苷5'二磷酸二鈉鹽78.125-5000pg/mlMMP-12MMP12|HME|ME|MME|Macrophage Metalloelastase|Macrophage Elastase

D-葡萄糖醛酸鈉(> 98%，BR)0.313-20ng/mlMMP-13|CLG3|MANDP1|Collagenase 3

乙二胺四乙酸二鈉一鈣鹽0.156-10ng/mlMMP-17|MMP17|MT4-MMP|matrix metallopeptidase 17(membrane-inserted)|matrix metalloproteinase-17|membrane-type matrix metalloproteinase 4|membrane-type-4 matrix metalloproteinase|MT4MMP|MT-MMP 4|MTMMP4

聚蔗糖700.156-10ng/mlMMP-24(Matrix Metalloproteinase 24)|MT5-MMP|matrix metallopeptidase 24(membrane-inserted)|matrix metalloproteinase-24|Membrane-type matrix metalloproteinase 5|Membrane-type-5 matrix metalloproteinase

碳酸胍(>98%,BR)0.156-10ng/mlMMP-3(Matrix Metalloproteinase 3)|Stromelysin 1|CHDS6|proteoglycanase|SL-1|STMY|STR1|stromelysin-1|transin-1|Transin-1

六次甲基四胺(>99%，BC)0.156-10ng/mlMMP-7(Matrix Metalloproteinase 7)|Matrilysin|matrilysin|matrin|Matrin|MPSL1|PUMP1|PUMP-1|Pump-1 protease|uterine matrilysin|Uterine metalloproteinase

鹽酸肼(>98%,BR)78.125-5000pg/mlMMP-8(Matrix Metalloproteinase 8)|Collagenase 2|CLG1HNC|neutrophil collagenase|PMNL collagenase|PMNL-CL

水合硫酸鐵(> 99%,BR)31.25-2000pg/mlMPIF2|MPIF-2|CCL24|Eotaxin-2|chemokine(C-C motif) ligand 24|Ckb-6|Eosinophil chemotactic protein 2|Eotaxin-2|member 24|MPIF-2|MPIF2Myeloid progenitor inhibitory factor 2|MPIF-2Small-inducible cytokine A24|SCYA24CK-beta-6

沒食子酸甲酯(>98%,BC)7.813-500pg/mlMelatonin

肌激酶(比活性：>200 U/mg,BC)0.313-20ng/mlMUC2|MLP|MUC-2|SMUC|Mucin-2

磷酸丙酮酸-環(huán)己胺鹽(>98%,BC)0.625-40ng/mlMYO(Myoglobin)|PVALB

對(duì)照品烏頭酶2檢測(cè)試劑盒20mg

乙氧基白屈菜紅堿 訂購|咨詢 規(guī)格： 20mg 腺苷活化蛋白激酶γ3抗體 AG ELISA Kit ?；囸I素(AG)ELISA試劑盒

骨保護(hù)素(OPG)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 NAA10 / ARD1A 蛋白 (His & GST 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷1.05439.0500

人前列腺素E1(PGE1) TRIM50  TRIM50蛋白抗體規(guī)格:96T/48TChloramphenicol規(guī)格:50mg促性腺激素平抑子檢測(cè)試盒10mg大鼠食管上皮細(xì)胞1x10^6cells

對(duì)照品無花果酶2檢測(cè)試劑盒20mg

羊藿(朝鮮羊藿)  英文名稱：Epimedium (Epimedium koreanum Nakai)   保存：-20℃   規(guī)格：0.2g 阿片樣物質(zhì)結(jié)合蛋白/細(xì)胞粘附分子樣蛋白抗體  

膽囊收縮素A受體(CCKAR)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 GSTZ1 蛋白 (His 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)1.15034.0500

人內(nèi)皮素1（ET1）ELISA KITTRIM5α/RNF88  環(huán)指蛋白88抗體規(guī)格:96T/48TChloramphenicol Palmitate規(guī)格:15mg促胰液素檢測(cè)試盒20mg大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞1x10^6cells

PhosphoWorks? 脂酰絲氨試劑（藍(lán)色熒光）20mg

 大豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum鏈霉素-青霉素(100X)

高端化學(xué), 檸檬鉀

97%100g100g門冬酰酶BrucellaIgG

溶劑綠 7(>85.0%(E)) 質(zhì)量規(guī)格：>85.0%(E) Pyranin

高端化學(xué), 酒石氫鉀

97%500g500g氨肽酶抑制劑鹽鹽ProthrombiIgM

瑞格非尼 質(zhì)量規(guī)格：>99%,多激酶抑制劑 Regorafenib(BAY 73-4506) 根瘤菌 Rhizobium sp.費(fèi)氏中華根瘤菌 Sinorhizobium fredii

高端化學(xué), 草氫鉀