PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。

外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

β-欖香酮酸PHF2 (D45A2) Rabbit mAb100 ul

藜蘆胺Bcl-2 (D17C4) Rabbit mAb (Mouse Preferred)20 ul

介芬胺Bcl-2 (D17C4) Rabbit mAb (Mouse Preferred)100μl

佛司可林EHMT1 (E6Q8B) Rabbit mAb300 ul

知母皂苷CSignalSilence? cdc2 siRNA I100 ul

青蒿素PDI (C81H6) Rabbit mAb20 ul

非洲防己堿PDI (C81H6) Rabbit mAb100 ul

絞股藍皂苷ACortactin Antibody100 ul
乳房鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒50% 戊二醛溶液78-5000pg/mlGrina|Protein lifeguard 1|Lfg1|Nmdara1|Glutamate [NMDA] receptor-associated protein 1|NMDA receptor glutamate-binding subunit|

6-糠基氨基嘌呤,激動素0.78-50ng/mlAox1|AOX1|aldehyde oxidase|aldehyde oxidase 1|AOAOH1|EC 1.2.3.1

乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸0.156-10ng/mlSipa1l1|SPA-1-like protein p1294|Spine-associated Rap GTPase-activating protein(SPAR)|

無水磷酸二氫鈉(分子生物學級)0.625-40ng/mlF2rl3|Coagulation factor II receptor-like 3|Thrombin receptor-like 3|

月桂?；“彼徕c(分子生物學級)0.156-10ng/mlNps

硫酸鎳六水0.312-20ng/mlCes5a|Carboxylesterase-like urinary excreted protein homolog(Cauxin)|Epididymis-specific gene 615 protein|

乙酸銨(分子生物學級)78-5000pg/mlMeteorin-like protein|Subfatin|Metrnl

微晶纖維素(100 um)0.625-40ng/mlSlc18a3|SLC18A3|MGC12716|SLC18A3|solute carrier family 18(vesicular acetylcholine)|member 3|Solute carrier family 18 member 3|solute carrier family 18|member 3|VAChT|VACHTvesicular acetylcholine transporter

乳糖；α-乳糖,一水0.156-10ng/mlSlc16a1|HHF7|SLC16A1|malignant T cell amplified sequence 1|Malignant T-Cell-Amplified Sequence 1|MCT-1|Multiple Copies T-Cell Malignancies

氯化鈣二水0.312-20ng/mlATP-dependent translocase ABCB1|ATP-binding cassette sub-family B member 1|Multidrug resistance protein 1|P-glycoprotein 1|Phospholipid transporter ABCB1|CD243|ABCB1|MDR1|PGY1

乙二醇0.312-20ng/mlAndpro|Androgen-regulated 20 kDa protein|Prostatic 22 kDa glycoprotein P22K16|P22K20|

硫酸鎂七水(分子生物學級)0.312-20ng/mlSult1e1|EST-1|STE|SULT1E1|EC 2.8.2|EST-1|ESTMGC34459|estrone sulfotransferase|ST1E1|STE|STEestrogen sulfotransferase|Sulfotransferase 1E1|sulfotransferase family 1E|estrogen-preferring|member 1|Sulfotransferase|estrogen-preferringEC 2.8.2.4|SULT1E1

糖化酶;葡萄糖淀粉酶0.312-20ng/mlSte2|Estrone sulfotransferase|Sulfotransferase|estrogen-preferring|

碘乙酰胺0.156-10ng/mlEST-3|Estrogen sulfotransferase|isoform 3|Estrone sulfotransferase|Sulfotransferase|estrogen-preferring|Ste

聚乙二醇40000.625-40ng/mlAtf2|Astrocyte-derived trophic factor|ATF|ATF1|ATF2|glial cell derived neurotrophic factor|glial cell line derived neurotrophic factor|glial cell line-derived neurotrophic factor|HFB1-GDNF|hGDNF|HSCR3

5Methoxypsoralen細胞色素c化酶亞基VIB多肽1檢測試劑盒20mg

鼠尾草;Carnosic acid 規(guī)格： 20mg 訂購|咨詢 WORT肉湯/WORT Broth真菌和酵母菌的培養(yǎng)250克國產(chǎn)/進口

Nuciferine頭孢地尼標準品規(guī)格：規(guī)格：人α血紅蛋白穩(wěn)定蛋白(AHSP)Polyclonal Antibody 0.2ml

Human antithrombin receptor,ATR ELISA Kit  人抗凝血酶受體CAS號：N酰L酪氨生育酚轉(zhuǎn)運蛋白檢測試盒25uHuman/人Elisa試盒3238402

Peucedanol細胞色素P450檢測試劑盒20mg

重樓皂苷 Ⅵ  英文名稱：Paris polyphylla saponin   保存：-20℃   規(guī)格：20mg 多效生長因子抗體

Biochanin A頭孢地尼相關(guān)物質(zhì)A標準品規(guī)格：規(guī)格：人蛋白激酶Bα(PKBα)Polyclonal Antibody 0.2ml

Human thrombin receptor,TR ELISA Kit  人凝血酶受體CAS號：鹽賴氨二氫黃醇4還原酶檢測試盒1KUHuman/人Elisa試盒3238402

Ratio Works? pH檢測劑II（細胞可透性）20mg

鹽士寧  英文名稱：Strychnine hydrochloride   保存：-20℃   規(guī)格：100mg 認知缺陷突觸相關(guān)蛋白SynGAP抗體

Common Nutrient Agar一般細菌的培養(yǎng)，分離培養(yǎng)霍亂弧菌，埋迪霉菌鑒定用信號素6B檢測試盒20mg胰島素樣生長子結(jié)合蛋白3檢測試盒OrexinReceptors

Ratio Works? pH檢測劑I（細胞可透性）20mg

棗仁皂苷D(標準品) 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品 Jujuboside D 血小板生成素(TPO)重組蛋白英文名稱：Recombinant Thrombopoietin (TPO)

King Medium A綠膿菌色素測定N端前尿皮質(zhì)素2檢測試盒20mg食欲素受體檢測試盒g(shù)astrinreceptor

腔腸素n20mg

維生素K1  英文名稱：Vitamin K1   保存：-20℃   規(guī)格：100mg 化Runx3抗體

Mannitol Ferment Medium腸道桿菌的鑒別，細菌甘露醇發(fā)酵試驗酯酶A2受體抗體檢測試盒20mg促胃液素受體檢測試盒ProproteinConvertaseSubtilisin;KexinType9
實驗過程:

一、試劑準備

1. DNA模板

2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。

４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。