PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時熒光定量PCR：

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

人β細(xì)胞素(BTC) ELISA試劑盒Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb (Biotinylated)300 ul

人本周蛋白(BJP) ELISA試劑盒Phospho-Met (Tyr1234/1235) Antibody100 ul

人Bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX)ELISA試劑盒 Phospho-Met (Tyr1234/1235) Antibody100 ul

人B細(xì)胞連接蛋白(BLNK)ELISA試劑盒 ALK (D5F3?) XP? Rabbit mAb (HRP Conjugate)300 ul

人B細(xì)胞淋巴瘤因子3(Bcl3)ELISA試劑盒Met (25H2) Mouse mAb100 ul

人B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)ELISA試劑盒Met (25H2) Mouse mAb100 ul

人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)ELISA試劑盒ARP2 Antibody20 ul

人堿性成纖維細(xì)胞生長因子9(bFGF-9)ELISA試劑盒ARP2 Antibody300 ul
牛血吸蟲探針法熒光定量PCR試劑盒保泰松0.156-10ng/mlPrl3d1

保泰松（標(biāo)準(zhǔn)品）78.125-5000pg/mlAdenosine deaminase|Adenosine aminohydrolase|ADA|ADA1

保泰松鈣46.875-3000pg/mlFurin|FUR

保泰松鈉1.563-100ng/mlHepcidin 25

鹽酸去氧腎上腺素78.125-5000pg/mlEGFR|ErbB-1|ErbB1|ERBB|HER1|Mena

鹽酸去氧腎上腺素（標(biāo)準(zhǔn)品）31.25-2000pg/mlGABA

吡非尼酮，哌非尼酮31.25-2000pg/mlNFE2-related factor 2|Nuclear factor|erythroid derived 2|like 2|Nfe2l2|Nrf-2

吡非尼酮,哌非尼酮(標(biāo)準(zhǔn)品)0.469-30ng/mlAnti-nuclear Antibody

匹伐他汀鈣78.125-5000pg/mlPlacenta-expressed transcript 1 protein

匹伐他汀鈣(標(biāo)準(zhǔn)品)78.125-5000pg/mlProtein Wnt-4

碘化鉀0.156-10ng/mlNeuromedin U receptor 1

吡喹酮31.25-2000pg/mlActivity dependent neuroprotector homeobox protein

吡喹酮（標(biāo)準(zhǔn)品）31.25-2000pg/mlIL8RB|CXC-R2|CXCR-2|CDw128b|GRO|MGSA receptor|High affinity interleukin-8 receptor B|IL-8R B|IL-8 receptor type 2|CD182|

鹽酸哌唑嗪0.313-20ng/mlLysyl Oxidase

醋酸潑尼松龍78.125-5000pg/mlHIF2a

Cochinchinenin C信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子5檢測試劑盒20mg

石菖蒲 訂購|咨詢 規(guī)格： 1.0g 人超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒人96T7.8-500 U/mL大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)ELISA試劑盒，英文名：GLUT1 ELISA Kit

巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 GATE-16 / GABARAPL2 蛋白 (His 標(biāo)簽)特價供應(yīng)1.16723.0500

人狀腺素(T4)DOM3Z  DOM3Z蛋白抗體規(guī)格:96T/48TCarbachol規(guī)格:50mg白細(xì)胞介素4檢測試盒20mg豬細(xì)胞，PK15細(xì)胞1x10^6cells

LOUREIRIN B信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子6檢測試劑盒200mg

羥乙基磺 質(zhì)量規(guī)格：>80%,粘狀液體 HES 大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基BSA標(biāo)準(zhǔn)梯度濃度試劑盒(即用型)-BSA

白介素9(IL9)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 DCXR / HCR2 蛋白 (His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷

人游離狀腺素(FreeT4)DR1 protein  轉(zhuǎn)錄下調(diào)蛋白1抗體規(guī)格:96T/48T規(guī)格:500mg白細(xì)胞介素5檢測試盒20mg大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞1x10^6cells

AcIETDAMC 20mg

飛龍掌血葉  英文名稱：Leaf of Asiatic Toddalia   保存：-20℃   規(guī)格：1g 化核因子2相關(guān)因子2抗體  

進(jìn)口、分裝11β羥類固醇脫氫酶1型檢測試盒100mgMouse/小鼠Elisa試盒51036

95%25g25g鄰硝基βD葡萄糖苷mumps virus antigen

鹽丁卡因  英文名稱：Tetracaine hydrochloride   保存：-20℃   規(guī)格：50mg Nogo66受體相關(guān)蛋白3抗體

Malonate Broth用于測定腸道細(xì)菌對二鹽的利用試驗(yàn)維生素K檢測試盒20mg化AKT蛋白檢測試盒Phosphotylinosital3kinase

95%5g1g鄰硝基βD葡萄糖苷paraoxonase

亞葉鈣  英文名稱：Calcium folinate   保存：-20℃   規(guī)格：100mg 食道癌抑制生長蛋白抗體

Dnase Agar用于細(xì)菌DNA酶檢測HLAⅡ類組織相容性抗原DP鏈檢測試盒20mg脂酰肌醇三羥基激酶檢測試盒apoproteinE
實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。