熒光定量PCR原理:

產品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術。該技術是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，根據(jù)最終的 PCR 產物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR產物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內參照法

在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗di高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。

外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

實驗過程:

一、試劑準備

1. DNA模板

2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。

４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產品僅用于科研試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。

人透明質酸酶(HAase)ELISA試劑盒 Bcl-w (31H4) Rabbit mAb100 ul

人透明質酸(HA)ELISA試劑盒SHIP1 (C15C9) Rabbit mAb100 ul

人透明質酸結合蛋白(HABP)ELISA試劑盒SHIP1 (P290) Antibody100 ul

人溶酶體相關膜蛋白2(HLAMP-2)ELISA試劑盒 SHIP1 (C40G9) Rabbit mAb100 ul

人H-ras ELISA試劑盒RNase L (D4B4J) Rabbit mAb100 ul

人激素敏感性脂肪酶(HSL)ELISA試劑盒 SHIP1 (D1163) Antibody250 ul

人同型半胱氨酸(Hcy)ELISA試劑盒Normal Rabbit IgG100 ul

人組蛋白H2b(histon-H2b)ELISA試劑盒SHIP2 Antibody100 ul
科恩酒曲菌探針法熒光定量PCR試劑盒9,10-dihydro-2,6（7）-二甲基蒽0.156-10ng/mlMeteorin-like protein|Subfatin|Metrnl

膽固醇78-5000pg/mlTymp|TP|dThdPase|ECGF1|Gliostatin|MEDPS1|MNGIE|MTDPS1|TdRPase|Thymidine Phosphorylase|TPase|TYMP|EC 2.4.2|EC 2.4.2.4|ECGF|TP|endothelial cell growth factor 1(platelet-derived)|gliostatin|Gliostatin|hPD-ECGF|MEDPS1|MNGIE|MTDPS1|PDECGF|PD-ECGF|Platelet-derived endothelial cell growth factor|TdRPase|tdRPase|thymidine phosphorylase

驅蛔78-5000pg/mlCrtac1|Aspic1|Cep68|Protein CRTAC1-B|68 kDa chondrocyte-expressed protein|CEP-68|ASPIC

（反）- 4-propyl-1-methyl-l-proline78-5000pg/mlAdipocyte enhancer-binding protein 1|Aebp1|AE-binding protein 1|Aortic carboxypeptidase-like protein|Aclp

1 -（2-羥乙基）- 4 -（甲基氨基）蒽醌0.312-20ng/mlSlc16a1|Mct1|MCT 1|Solute carrier family 16 member 1

1 -（3-吡啶基）- 1-butanone-4-carboxylic acid-d431.2-2000pg/mlZbtb3

anticefepime0.156-10ng/mlATP-dependent translocase ABCB1|ATP-binding cassette sub-family B member 1|Multidrug resistance protein 1|P-glycoprotein 1|Phospholipid transporter ABCB1|CD243|ABCB1|MDR1|PGY1

3 -（氯甲基）-甲基吡啶0.312-20ng/mlATP-binding cassette sub-family G member 3|Abcg3

5-acetoxymethyl-2,3-dimethyl-4-chloropyridine N-氧化物0.156-10ng/mlEapa2

二malonate-13c278-5000pg/mlPrl8a8|Prlpc3|Placental prolactin-like protein C3|PLP-C3|PRL-like protein C3|Prolactin-like protein C-gamma|PLP C-gamma

乙炔基雌二醇0.156-10ng/mlSerpina3g|Spi2A|Serpin A3G|Serine protease inhibitor 2A|Serpin 2A

維達洛芬15.6-1000pg/mlNox1|NOH-1|Mitogenic oxidase 1(MOX-1)|NADH|NADPH mitogenic oxidase subunit P65-MOX|Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Oxidase 1

α-利巴韋林（病毒唑雜質B0.156-10ng/mlAgtr1b|AT3|Angiotensin II type-1B receptor|AT1B

甲基4-deoxy—0.156-10ng/mlPrss29|Isp2|Tryptase-like proteinase|Strypsin-related protein|Implantation serine proteinase 2|ISP-2|Strypsin-2|

12,15,18,21,24,27,30-heptaoxahentraconta-1,40-diene0.156-10ng/mlTxlna|TXLNA|IL-14|alpha-taxilin|IL14|interleukin 14|taxilin alpha|TXLN

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