定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

人N端外顯肽(Ext-N)ELISA試劑盒Phospho-SF3B1 (Thr313) (D8D8V) Rabbit mAb100 ul

人去甲腎上腺素(NA) ELISA試劑盒VE-Cadherin (D87F2) XP? Rabbit mAb20 ul

人重酒石酸去甲腎上腺素(NE-B)ELISA試劑盒VE-Cadherin (D87F2) XP? Rabbit mAb100 ul

人非小細(xì)胞肺癌抗原(LTA)ELISA試劑盒TORC1/CRTC1 Antibody100 ul

人未磷酸化類胰島素生長因子結(jié)合蛋白-1ELISA試劑盒 Vav1 Antibody100 ul

人非神經(jīng)元性烯醇化酶(NNE)ELISA試劑盒 Stargazin Antibody100 ul

人非甲基化寡核苷酸(NON)ELISA試劑盒 PD-L1 (Extracellular Domain Specific) (D8T4X) Rabbit mAb (Alexa Fluor? 488 Conjugate)100 ul

人NOD樣受體(NLR)ELISA試劑盒APC Antibody100 ul
中間普雷沃菌探針法熒光定量PCR試劑盒小鼠胰淀素(Amylin)15.625-1000pg/mlCachectin|DIF|TNF|TNF a|TNF alpha|TNFA|TNFSF2|TNFα|Tumor necrosis factor

小鼠白三烯C4(LTC4)31.25-2000pg/mlBDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor)|ANON2|BULN2|Abrineurin|neurotrophin

小鼠細(xì)胞色素C（Cytochrome C）15.63-1000ng/mlIrisin

小鼠血管緊張素I（Ang I）0.156-10ng/mlVisfatin

小鼠黑色素細(xì)胞抗體（melanocyte）0.156-10ng/mlTFPI(Tissue Factor Pathway Inhibitor)|EPI|LACI|TFI|TFPI1|lipoprotein-associated coagulation inhibitor

小鼠二肽基肽酶IV（DPP4）1.563-100ng/mlIGF-1|IGF1|IGFI|IGF-I|IGF1A|IGF-IA|IGF-IB|MGF|Somatomedin C

小鼠補(bǔ)體片斷C4a（C4a）3.125-200ng/mlTAFI

小鼠補(bǔ)體片斷C5a（C5a）0.391-25ng/mlCortisol

小鼠補(bǔ)體片斷C3a（C3a）0.313-20ng/mlPAI-1|PAI1|SERPINE1|Nexin|PLANH1|Endothelial plasminogen activator inhibitor|PAISerpin E1|PLANH1|plasminogen activator inhibitor 1|serine(or cysteine) proteinase inhibitor|clade E(nexin|plasminogenactivator inhibitor type 1)|member 1|serpin peptidase inhibitor|clade E(nexin|plasminogen activator inhibitortype 1)|member 1

小鼠卵泡抑素(FS) 62.5-4000pg/ml uPA|PLAU|Urokinase|ATF|plasminogen activator|urokinase|UPA|u-PA|U-plasminogen activator|urinary|urokinase-type plasminogen activator

小鼠組織蛋白去乙?；?/font>(HD) 15.625-1000pg/mlβ-EP(Beta-Endorphin)

小鼠甲基化酶(Methylase) 0.781-50ng/mlSOD1|Cu-Zn SOD|Ipo1|IPOA|SOD|cytosolic|SOD|Soluble|ALS|ALS1|amyotrophic lateral sclerosis 1(adult)|Cu|Zn superoxide dismutase|hSod1|indophenoloxidase A|IPOA|SOD|Superoxide dismutase 1|superoxide dismutase 1|soluble|superoxide dismutase|cystolic

小鼠增殖細(xì)胞抗原(PCNA)0.313-20ng/mlGpx1|CGPx|GPX1|GSHPX1|Cellular glutathione peroxidase|EC 1.11.1|EC 1.11.1.9|glutathione peroxidase 1|GPx-1|GSHPX1|GSHPx-1|MGC14399|MGC88245

小鼠脂蛋白脂酶(LPL) 0.156-10ng/mlCat|Cas1|CAT|Cs-1|catalase|EC 1.11.1.6|MGC138422|MGC138424

小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)0.156-10μg/mlAdiponectin|ADIPOQ|30 kDa adipocyte complement-related protein|Adipocyte complement-related 30 kDa protein|ACRP30|Adipocyte, C1q and collagen domain-containing protein|Adipose most abundant gene transcript 1 protein|apM-1|ACDC|ACRP30|APM1|GBP28

AR,98%25g1g二柯楠因65281platelet antibodies IgM

 S-Medium(milieu S)BR10升國產(chǎn)/進(jìn)口

1-芐基-3-基-5-氨基吡唑鹽鹽標(biāo)準(zhǔn)品

人組織蛋白去?；?/font>(HD) Salmonella enteritidis H  傷寒沙門氏菌鞭毛抗原H抗體規(guī)格:96T/48TBetazole Hydrochloride規(guī)格:50mgβ聯(lián)蛋白檢測(cè)試盒20mg人尤文氏肉瘤細(xì)胞，TC32細(xì)胞1x10^6cells

AR,98%25g5g柯楠因22199082platelet antibodies IgG

異甘草素（標(biāo)準(zhǔn)品） 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品 Isoliquiritigenin

VA(Human Vitamin A) ELISA Kit  人維生素ACAS號(hào)：27522金屬忍耐蛋白檢測(cè)試盒500mgHuman/人Elisa試盒315300

TQ320mg

 大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基100mL

Apo J/Clusterin Alpha/ Beta(Apolipoprotein J)  凝聚素α/β抗原進(jìn)口、分裝淀粉酶檢測(cè)試盒100gHuman/人Elisa試盒50419

TQ3 20mg

甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=5%) 質(zhì)量規(guī)格：100μg/ml,u=5% Metalaxyl solution

Insulin ReceptorAlpha(ISRAlpha)  胰島素受體α（抗原）進(jìn)口、原裝TAU181蛋白檢測(cè)試盒500gHuman/人Elisa試盒504303

TQ2琥珀酰亞 20mg

槲皮素;Quercetin 訂購|咨詢 規(guī)格： 100mg 8號(hào)染色體開放閱讀框44抗體 CENPF ELISA Kit 著絲粒蛋白F(CENPF)ELISA試劑盒

Tryptic Soy Agar培養(yǎng)副溶血性弧菌，做細(xì)胞色素氧化酶實(shí)驗(yàn)合胞素1檢測(cè)試盒20mg血管性血友病子檢測(cè)試盒hemeoxygenase1