定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

人L選擇素(L-Selectin/CD62L)ELISA試劑盒Phospho-PAK1 (Ser144)/PAK2 (Ser141) Antibody20 ul

人苯丙氨酸(LPA)ELISA試劑盒 Phospho-PAK1 (Ser144)/PAK2 (Ser141) Antibody100 ul

人L苯丙氨酸解氨酶(PAL)ELISA試劑盒 Phospho-PAK2 (Ser20) Antibody20 ul

人低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(LRP-6)ELISA試劑盒Phospho-PAK2 (Ser20) Antibody100 ul

人低分子質(zhì)量蛋白7/β型蛋白酶體9(LMP7/PSMB9)ELISA試劑盒PAK2 Antibody100 ul

人低分子肝素(LMWH)ELISA試劑盒 PAK3 Antibody20 ul

人低密度脂蛋白(LDL)ELISA試劑盒PAK3 Antibody1 Kit

人長效甲狀腺刺激素(LATS)ELISA試劑盒 PTMScan? Glutaryl-Lysine [Glut-K] Kit100 ul
鼻疽假單胞菌探針法熒光定量PCR試劑盒RAC經(jīng)茉莉酸7.813-500pg/mlPodxl|PCX(Podocalyxin)|PODXL|PCLP|PCLP1|Podocalyxin-like protein 1|PC|PCLP-1|GCTM-2 antigen|Gp200

丙烯醛（穩(wěn)定與對(duì)苯二酚）7.8-500pg/mlHcrt|HCRT|OX|PPORX|PPOX|Orexin|Hypocretin|Hcrt

1,3,7-trichloronaphthalene1.563-100ng/mlBcl2|Bcl-2|apoptosis regulator Bcl-2|B-cell CLL|lymphoma 2

4-acetamido-5-chloro-2-ethoxy-benzoic酸甲基ester-d53.12-200ng/mlSparc|SPARC|BM-40|Osteonectin|Basement-membrane protein 40|BM-40|ONcysteine-rich protein|osteonectin|Osteonectin|Secreted protein acidic and rich in cysteine|secreted protein|acidic|cysteine-rich(osteonectin)

四氫醛固酮0.938-60ng/mlAgt(Angiotensinogen)|ANHU|Serpin A8|SERPINA8|Angiotensin II|Aogen|PAT|alpha-1 antiproteinase|antitrypsin|angiotensin II|pre-angiotensinogen|serine(or cysteine) proteinase inhibitor|SERPINA8|angiotensin I

rac-cis-n-desmethyl鹽酸舍曲林0.156-10ng/mlPAPPA|PAPP-A(Pappalysin-1)|PAPA|DIPLA1|IGFBP-4ase|PAPPA1|ASBABP2|Pappalysin 1|Pregnancy Associated 硫藤黃0.313-20ng/mlCrh(Corticotropin Releasing 乙酯15.6-1000pg/mlGnrh1|Progonadoliberin-1|GNRH|GRHLHRH|Progonadoliberin I

（4S）- 6-methyl-4-phenylchroman-2-one3.125-200ng/mlF11|Coagulation factor XI|FXI|Plasma thromboplastin antecedent|PTA

3-羥基（5-hydroxypentyl）chromen-4-one0.781-50ng/mlScgb1a1|CC16|Blastokinin|CC10|CCPBP|CCSP|Clara|PCB-BP|SCGB1A1|UGB|blastokinin|CC10Urine protein 1|CC16|CCSPCCPBP|Clara cell phospholipid-binding protein|Clara cells 10 kDa secretory protein|Secretoglobin family 1A member 1|secretoglobin|family 1A|member 1(uteroglobin)|UGBUP-1|UP1|Urinary protein 1|uteroglobin

（1S，2R，5S）-（+）-薄荷醇1.563-100ng/mlGADAb

Costunlide血漿激肽釋放酶檢測試劑盒10mg

人參皂苷Rg2(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品 Ginsenoside Rg2 不吸水鏈霉菌 Streptomyces ahygroscopicus豇豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium vigna

Euhorbiasteroid越橘提取物標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人載脂蛋白A4(apo-A4)CLIA試劑盒 0.2ml

aZP(Human antizona pellucida antibody,aZP) ELISA Kit  人抗透明帶抗體CAS號(hào)：青霉素V3甘油激酶檢測試盒5gHuman/人Elisa試盒31599607

Dehydrocostus Lactone血漿抗凝蛋白S檢測試劑盒20mg

洋艾素;Absinthin 訂購|咨詢 規(guī)格： 20mg 人Apelin(APLN)ELISA試劑盒人96T62.5-4000 pg/mL小鼠血管生成素4(ANG-4)ELISA試劑盒，英文名：ANG-4 ELISA Kit

胰島素(INS)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 Siglec-2 / CD22 蛋白 (aa 176-687, His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷1.02249.0001

AOAb(Human AntiOvary Antibody,AOAb) ELISA Kit  人抗卵巢抗體CAS號(hào)：舒他西林甘油醛3脫氫酶檢測試盒100mgHuman/人Elisa試盒31599607

97%25g25g尿素酶（巨豆）Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl1

N-三甲基硅基咪唑(>98.0%(T)) 質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(T) N-Trimethylsilylimidazole

進(jìn)口、分裝3α羥基類固醇3脫氫酶檢測試盒1gHuman/人Elisa試盒50528808

95%1g100g尿素酶（巨豆）Vitamin Dbinding protein 1

對(duì)羥基甲甲酯  英文名稱：P-hydroxy benzoic acid methyl ester   保存：-20℃   規(guī)格：100mg 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣蛋白2抗體

進(jìn)口、原裝3α羥基類固醇脫氫酶檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒50530126

TF4 20mg

白樺醇酯 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢 人整合素α4(Integrin alpha-4)ELISA試劑盒人96T0.156-10 ng/mL小鼠β2-微球蛋白(β2M)ELISA試劑盒，英文名：β2M ELISA Kit

現(xiàn)貨供應(yīng)20α羥基類固醇脫氫酶檢測試盒5gHuman/人Elisa試盒50530126