定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

人可溶性凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(sLOX-1)ELISA試劑盒HER2/ErbB2 (44E7) Mouse mAb100 ul

人白介素2可溶性受體α鏈(IL-2sRα/CD25)ELISA試劑盒Phospho-HER2/ErbB2 (Tyr1221/1222) Antibody100 ul

人白介素1可溶性受體Ⅱ(IL-1sRⅡ)ELISA試劑盒c-Fos (9F6) Rabbit mAb100 ul

人白介素1可溶性受體Ⅰ(IL-1sRⅠ)ELISA試劑盒FosB (5G4) Rabbit mAb20 ul

人可溶性細(xì)胞間粘附分子1(sICAM-1)ELISA試劑盒FosB (5G4) Rabbit mAb100 ul

人可溶性白細(xì)胞抗原G(sHLA-G)ELISA試劑盒PRMT5/Skb1Hs Methyltransferase Antibody100 ul

人可溶性血纖蛋白單體復(fù)合物(SFMC)ELISA試劑盒Toll-like Receptor 9 Antibody100 ul

人可溶性凋亡相關(guān)因子配體(sFASL)ELISA試劑盒EGF Receptor (EGFR1) Mouse mAb (IP Specific)100 ul
皺褶青霉探針法熒光定量PCR試劑盒大鼠的牛血清白蛋白殘留檢測31.25-2000pg/mlSTUB1|HSPABP2|NY-CO-7|SDCCAG7|STUB1|UBOX1|Antigen NY-CO-7|Carboxy terminus of Hsp70-interacting protein|CHIPSTIP1 homology and U box-containing protein 1|CLL-associated antigen KW-8|E3 ubiquitin-protein ligase CHIP|EC 6.3.2.-|heat shock protein A binding protein 2(c-terminal)|HSPABP2|NY-CO-7|SDCCAG7|serologically defined colon cancer antigen 7|STIP1 homology and U-box containing protein 1|STIP1 homology and U-box containing protein 1|E3 ubiquitin protein ligase|UBOX1

大鼠凝血因子II（FII）0.313-20ng/mlSUMO2|Small Ubiquitin Related Modifier 2

大鼠內(nèi)毒素（endotoxin）ELISA Kit0.156-10ng/mlSYCN|Syncollin

大鼠過氧化物酶體增殖因子活化受體γ( PPAR-γ)ELISA Kit0.625-40ng/mlSYK|EC 2.7.10|EC 2.7.10.2|spleen tyrosine kinaseFLJ37489|tyrosine-protein kinase SYK

大鼠環(huán)胞霉素A(CSA)4.688-300ng/mlTA|Anti-Teichoic Acid Antibody

大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）46.875-3000ng/mlTAB

大鼠β2糖蛋白1抗體Ig(A,G,M)(β2-GP1)ELISA Kit0.313-20ng/mlTACR1|Tachykinin Receptor 1

大鼠抗子宮內(nèi)膜抗體（AEA）ELISA Kit0.313-20ng/mlTACR2|Tachykinin Receptor 2

大鼠白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)0.313-20ng/mlTAF|TATA Box Binding Protein|TBP-Associated Factors

大鼠低密度脂蛋白免疫復(fù)合物(LDL-IC)0.313-20ng/mlTAF13|TATA Box Binding Protein Associated Factor 13

大鼠神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)ELISA Kit0.625-40ng/mlTAGLN|SM22 alpha|TAGLN|WS3-10|Protein WS3-10|SM2222 kDa actin-binding protein|Smooth muscle protein 22-alpha|TAGLN1|transgelin|transgelin variant 2|WS3-10SM22-alpha

大鼠抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(甲醛固定)（pANCA）0.156-10ng/mlTALLA-1

大鼠15-脂加氧酶(15-LO)ELISA試劑盒0.313-20ng/mlTARS

大鼠心肌肌鈣蛋白I（cTnI）ELISA試劑盒0.156-10ng/mlTBX2|FLJ10169|T-box 2|T-box transcription factor TBX2

大鼠血清淀粉樣蛋白A（SAA）31.25-2000pg/mlTCC C5b-9

指示劑級25g5g楮樹黃醇B23513157tartrateresistant acid phosphatase

異甜菊醇 ;isosteviol 規(guī)格： 20mg 訂購|咨詢 中性蛋白酶(含100mL酶解緩沖液)10mL

催乳素(PRL)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)重組人 TSPAN8 / Tetraspanin 8 / TM4SF3 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)特價供應(yīng)1000 mL/瓶

人8羥基脫氧鳥苷（8OHdG）phosphoCPLA2(Ser505)  化胞漿型脂酶A2抗體規(guī)格:96T/48TBehenoyl Polyoxylglycerides規(guī)格:10mgα1微球蛋白檢測試盒20mg人食管癌細(xì)胞，TE1細(xì)胞1x10^6cells

指示劑級10g25g桑呋A126192antifilaggrin antibody

亞鈉  英文名稱：Sodium selenite   保存：-20℃   規(guī)格：50mg 化復(fù)制因子A蛋白2抗體

抵抗素(RETN)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)重組人 RANKL / OPGL / TNFSF11 / CD254 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷5000 mL/瓶

VGCC(Human voltagegated calcium channel) ELISA Kit  人鈣離子通道抗體CAS號：1545801黃醇合成酶檢測試盒100KUHuman/人Elisa試盒313724

Super Fluor 647（效果同Alexa Fluor 647）20mg

龍膽花  英文名稱：Gentian flowers   保存：-20℃   規(guī)格：0.5g 高度相似的細(xì)胞周期蛋白激酶NEK6抗體  

FGF1 (aFGF )(ECGFbeta)(HBGF1)  肝素結(jié)合生長子( 性成纖維細(xì)胞生長子）（多肽片斷抗原）進口、分裝?；囸I素檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒4998769

Super Fluor 555（效果同Alexa Fluor 555）20mg

豆蔻木脂素 訂購|咨詢 規(guī)格： 20mg 敏感離子通道1抗體 hnRNP L ELISA Kit 異質(zhì)性胞核核糖核蛋白L(hnRNP L)ELISA試劑盒

ECG2 (sophagus cancerrelated gene2)  食道癌相關(guān)基（抗原）進口、原裝饑餓素檢測試盒500gHuman/人Elisa試盒4998769

Super Fluor 488（效果同Alexa Fluor 488） 20mg

狼毒乙素  英文名稱：Fischeriana B   保存：-20℃   規(guī)格：20mg/支 絲氨/蘇氨蛋白激酶PCTK2抗體

BGS Agar沙門氏菌分離培養(yǎng)脂肪檢測試盒20mg凝血酶原片段F1+2檢測試盒coagulationfactorⅡ