PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時熒光定量PCR：

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

人可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(sTfR)ELISA試劑盒HER2/ErbB2 Antibody100 ul

人可溶性核因子κB受體活化因子配基(sRANKL)ELISA試劑盒HER2/ErbB2 Antibody300 ul

人可溶性P選擇素(sP-selectin)ELISA試劑盒Phospho-HER2/ErbB2 (Tyr1221/1222) (6B12) Rabbit mAb100 ul

人S100B蛋白(S-100B)ELISA試劑盒Phospho-HER2/ErbB2 (Tyr1221/1222) (6B12) Rabbit mAb20 ul

人S100蛋白(S-100)ELISA試劑盒Phospho-HER2/ErbB2 (Tyr1221/1222) (6B12) Rabbit mAb100 ul

人可溶性蛋白185(sp185/HER-2)ELISA試劑盒Phospho-HER2/ErbB2 (Tyr1248)/EGFR (Tyr1173) Antibody100 ul

人可溶性磷脂酶A2(sPL-A2)ELISA試劑盒Phospho-HER2/ErbB2 (Tyr1248) Antibody20 ul

人可溶性肌球蛋白重鏈1(sMHC-1)ELISA試劑盒Phospho-HER2/ErbB2 (Tyr1248) Antibody100 ul
產(chǎn)紫青霉探針法熒光定量PCR試劑盒大鼠促腎上腺激素皮質(zhì)激素(Rat ATH)0.313-20pmol/mlSMRP|Soluble Mesothelin Related Peptide

大鼠絨毛促性腺激素(HCG)0.313-20ng/mlSynuclein Gamma|SNCG|BCSG1|PRSN|Synoretin|PERSYN|Persyn|SRPRSN|Breast cancer-specific gene 1 protein|gamma-synuclein|synuclein|gamma(breast cancer-specific protein 1)

大鼠促黃體激素(LH)15.625-1000pg/mlSPA(Pulmonary Surfactant Associated Protein A)|SFTPA1|COLEC4|PSAP|SFTP1|SFTPA|SFTPA1B|PSP-A|PSPA|SP-A|SP-A1|Collectin-4|35 kDa pulmonary surfactant-associated protein|Alveolar proteinosis protein

大鼠促卵泡生長激素(Rat FSH)1.563-100ng/mlSPD(Pulmonary Surfactant Associated Protein D)|SFTPD|SP-D|Collectin 7|PSP-D|SFTP4|COLEC7|collectin-7|Lung surfactant protein D|PSPD|pulmonary surfactant-associated protein D|pulmonary surfactant apoprotein|surfactant protein D|surfactant|pulmonary-associated protein D|surfactant-associated protein|pulmonary 4

大鼠促乳素(Prolactin)0.313-20ng/mlSPG|Surfactant Associated Protein G|Surfactant-associated protein 2|SFTA2

大鼠疊氮胸苷(AZT)15.625-1000pg/mlSPTAN1|Alpha-Fodrin

大鼠高靈敏度促性腺激素(U-TSH)0.156-10ng/mlSPTβN4|Spectrin Beta|Non Erythrocytic 4

大鼠高敏甲狀腺素(T4)15.625-1000pg/mlsSELP|Soluble P-Selectin

大鼠谷氨酸脫羧酶自身抗體(GAD) 0.156-10ng/mlSSTR1|Somatostatin Receptor 1

大鼠多巴胺(dopamine) 0.156-10ng/mlST2|Syntenin 2

大鼠甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP) 0.156-10ng/mlSTAT1|CANDF7|ISGF-3|STAT91|DKFZp686B04100|ISGF-3|91kD|signal transducer and activator of transcription 1|91kDa|signal transducer and activator of transcription-1

大鼠心磷脂抗體Cardiolipin IgG(ACAIgG）0.313-20ng/mlSTAT4|signal transducer and activator of transcription 4|SLEB11

大鼠心磷脂抗體Cardiolipin IgM （ACAIgM）0.781-50ng/mlSTK39|Serine|Threonine Kinase 39

大鼠心磷脂抗體Cardiolipin IgA(ACAIgA)0.156-10ng/mlSTMN1|Stathmin 1

大鼠干擾素α（IFNα）ELISA Kit31.25-2000pg/mlsTREM-1|soluble Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1

≥98%10g1g桑根醇 L20633674Attacin

貝母素乙 訂購|咨詢 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 人肥大細(xì)胞羧肽酶3(CPA3)ELISA試劑盒人96T0.78-50 ng/mL小鼠補(bǔ)體蛋白5(C5)ELISA試劑盒，英文名：C5 ELISA Kit

催乳素(PRL)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 REG4 / RELP / GISP 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)特價供應(yīng)25000mL/瓶

人脂聯(lián)素（ADT）NGN1/Neurogenin 1  神經(jīng)元素1抗體規(guī)格:96T/48TBalsalazide Related Compound B規(guī)格:200mgα1抗胰蛋白酶檢測試盒20mg人食管癌細(xì)胞，EC9706細(xì)胞1x10^6cells

≥98%100g5MG高良姜素 3O30462352tartrateresistant acid phosphatase 5b

軟骨素 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢 ELISA Kit for Human Neurogenic locus notch homolog protein 1大鼠甲種胎兒球蛋白/甲胎蛋白(AFP)ELISA試劑盒，英文名：AFP ELISA Kit

催乳素(PRL)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 N-Cadherin / CD325 / CDH2 蛋白 (His & Fc 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷500 mL/瓶

人抗嗜中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA）Ubiquityl Histone H2A.X (Lys119)  泛素化組蛋白H2AX抗體規(guī)格:96T/48TBeclomethasone Dipropionate規(guī)格:200mgα1性糖蛋白檢測試盒5mg人食管癌細(xì)胞，Eca細(xì)胞1x10^6cells

97%1g100mlα葡萄糖苷酶apoprotein A1 antibody

4'-羧基并-15-冠5-(>98.0%(GC)(T)) 質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(GC)(T) 4'-Carboxybenzo-15-crown 5-Ether 白靈側(cè)耳 Pleurotus nebrodensis

FasL(抗原)  進(jìn)口、原裝N酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶II檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒499810

98%5ml5mgα葡萄糖苷酶Furin

吳茱萸次堿;Rutaecarpine 訂購|咨詢 規(guī)格： 20mg 轉(zhuǎn)錄因子Gli2抗體 BMP3 ELISA Kit 骨成型蛋白3(BMP3)ELISA試劑盒

Ah Receptor(Aryl Hydrocarbon Receptor)  芳香烴受體抗原現(xiàn)貨供應(yīng)多聚ADP核糖聚合酶檢測試盒5gHuman/人Elisa試盒499832

98%25ml5gβ葡萄糖苷酶Hemagglutinating virus of Japan

維生素E;純品型;標(biāo)準(zhǔn)品(α-生育酚); 規(guī)格： 0.5g 訂購|咨詢 人腺細(xì)胞英文名稱：Hs 578T

Fe65 protein peptide  Fe65 蛋白（多肽抗原）特價促銷酪氨酶檢測試盒100gHuman/人Elisa試盒499832
實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。