熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

人胸腺肽(Thymosin)ELISA試劑盒Presenilin 2 Antibody100 ul

人胸腺五肽(TP-5)ELISA試劑盒RPA70/RPA1 (C24F2) Rabbit mAb1 mg

人胸苷酸合成酶(TS)ELISA試劑盒MG-132100 ul

人胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(TP)ELISA試劑盒Mnk1 (C4C1) Rabbit mAb100 ul

人胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)ELISA試劑盒ESET (C1C12) Rabbit mAb20 ul

人血栓前體蛋白(TpP)ELISA試劑盒ESET (C1C12) Rabbit mAb100 ul

人血栓素B2(TXB2)ELISA試劑盒Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb20 ul

人血栓素A2(TX-A2)ELISA試劑盒 Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb100 ul
戊糖片球菌探針法熒光定量PCR試劑盒大鼠細(xì)胞周期素D3(Cyclin D3)0.156-10ng/mlPDIA6

大鼠細(xì)胞周期素D2(Cyclin D2)1.563-100ng/mlPDK4|PDHK4|Pyruvate Dehydrogenase Kinase Isozyme 4

大鼠細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)0.313-20ng/mlPDP

大鼠髓磷脂堿蛋白（MBP）0.313-20ng/mlPEX2|PAF-1|PAF1|PMP3|PMP35|PXMP3|RNF72|RING finger protein 72|Peroxisome assembly factor 1|Peroxisomal membrane protein 3|35 kDa peroxisomal membrane protein|Peroxin-2

大鼠甲胎蛋白（AFP） 1.563-100ng/mlPF4V1|CXCL4V1|SCYB4V1|PF4var1|PF4alt|C-X-C motif chemokine 4 variant|CXCL4L1

大鼠前列腺酸性磷酸酶（PAP） 0.313-20ng/mlPFKM|GSD7|PFK-1|PFK-A|PFKM|PFKX|Phosphofructokinase-1|Phosphofructokinase-M|Phosphohexokinase|6-phosphofructokinase|muscle type|EC 2.7.1|6-phosphofructo-1-kinase|EC 2.7.1.11|GSD7|MGC8699|PFK1|PFKA|PFK-A|PFKX|Phosphofructo-1-kinase isozyme A|Phosphofructokinase 1|phosphofructokinase|muscle|phosphofructokinase|polypeptide X|phosphofructokinase-M|Phosphofructokinase-M|phosphohexokinase|Phosphohexokinase

大鼠游離前列腺特異性抗原(FREE PSA)0.313-20ng/mlPFKP|PFKF|PFK-C|Phosphohexokinase|Phosphofructokinase 1|6-phosphofructokinase|platelet type|Phosphofructo-1-kinase isozyme C|6-phosphofructokinase type C

大鼠前列腺特異性抗原(PSA)0.781-50ng/mlPGAM1|CDABP0006|PGAMA|PGAM-B|BPG-dependent PGAM 1|Phosphoglycerate mutase isozyme B

大鼠卵巢癌標(biāo)志物(CA125)62.5-4000pg/mlPGD2S|Cerebrin-28|PDS|PGD2|PGDS2|PH2DISO|PTGDS|Beta-trace protein|cerebrin-28|Cerebrin-28|EC 5.3.99.2|Glutathione-independent PGD synthase|glutathione-independent PGD synthetase|lipocalin-type prostaglandin D synthase|Lipocalin-type prostaglandin-D synthase|L-PGDS|PDS|PGD2|PGD2 synthase|PGDS2|PGDSLPGDS|prostaglandin D synthase|prostaglandin D2 synthase(21kD|brain)|prostaglandin D2 synthase 21kDa(brain)|Prostaglandin-D2 synthase|prostaglandin-H2 D-isomerase

大鼠乳腺癌標(biāo)志物(CA153)7.813-500pg/mlPGF2α

大鼠胃腸癌標(biāo)志物(CA199)0.313-20ng/mlPGRP-S|TAG7|TNFSF3L|peptidoglycan recognition protein 1|Peptidoglycan recognition protein short|PGLYRP|PGRPpeptidoglycan recognition protein|PGRP-SMGC126894|PGRPSMGC126896|TAG7|TNF superfamily|member 3(LTB)-like(peptidoglycan recognition protein)|TNFSF3L|PGLYRP1

大鼠血紅素氧合酶1(HO-1) 0.313-20ng/mlPHB|PHB1|prohibitin

大鼠磷脂酶A2（sPLA2）0.156-10ng/mlPIK3Cβ|PIK3C1|PI3-kinase subunit beta|PI3K-beta|PI3Kbeta|PtdIns-3-kinase subunit p110-beta|p110beta|PtdIns-3-kinase subunit beta|Phosphatidylinositol-4|5-bisphosphate 3-kinase 110 kDa catalytic subunit beta

大鼠組織因子途徑抑制物（TFPI）0.781-50ng/mlPK|PKLR(pyruvate kinase isozyme R|L)|PK1|PKL|RPK|PK1|PKRL|PKR|Pyruvate kinase 1|pyruvate kinase type L|pyruvate kinase|liver and blood cell|pyruvate kinase|liver and RBC|Red cell|liver pyruvate kinase|R-type|L-type pyruvate kinase

大鼠水通道蛋白5（AQP5）0.313-20ng/mlPK2(Prokineticin-2)|PROK2|BV8|Protein Bv8 homolog

98%1g1g筋骨草素F4568730cyclic citrullinated peptide antibody

齊墩果 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥95%，BR Oleanolic acid

促腎上皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)重組人 ICAM4 / CD242 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷200g/瓶

人B淋細(xì)胞趨化子12(CXCL12)MLLT11  髓系/淋或混合型白血病11抗體規(guī)格:96T/48TOpen Ring Aztreonam規(guī)格:250mgVasorin;SLITlike 2檢測試盒5mg人癌細(xì)胞，A498細(xì)胞1x10^6cells

98%500mg250mg地芰普內(nèi)20958183antiproliferative factor

 C918(人眼脈絡(luò)黑色素瘤細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

Swertiamarin阿扎隆標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人環(huán)AMP依賴性轉(zhuǎn)錄因子（ATF-2）Polyclonal Antibody 0.2ml

Alpha2PI (Human Alpha2plasmin inhititor) ELISA Kit  人α2纖溶酶抑制物CAS號：2594628GDPD甘露糖焦化酶檢測試盒100mlHuman/人Elisa試盒3133786

7基3羧基香豆素 5mg

異茴芹素;Isopimpinellin( 規(guī)格： 20mg 訂購|咨詢 BDS培養(yǎng)基/BDS Medium擬桿菌的分離培養(yǎng)250克國產(chǎn)/進口

Endothelin1 (ET1)  內(nèi)皮素1（抗原）進口、原裝13羥基十八碳二烯檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒498942

7羥基4基香豆素3琥珀酰亞5mg

糖精 訂購|咨詢 規(guī)格： 1000mg KB抑制蛋白激酶α/IκBα/IKK-α/IKKα/I-κB-α 抗體 SNAI1 ELISA Kit Snail同源物1(SNAI1)ELISA試劑盒

ERAB   內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Aβ相關(guān)結(jié)合蛋白（抗原）現(xiàn)貨供應(yīng)低氧誘導(dǎo)子α檢測試盒5gHuman/人Elisa試盒498942

98%500g1gβ葡萄糖苷酶NmethylDasparate receptor antibody

托吡卡 訂購|咨詢 規(guī)格： 100mg 化乙酰輔酶A羧化酶抗體 MBP antibody ELISA Kit 髓鞘堿性蛋白抗體(MBP antibody)ELISA試劑盒

Baird Parker Agar凝固酶陽生葡萄球菌的選擇性分離培養(yǎng)麥醇溶蛋白檢測試盒20mg硫氧化還原蛋白檢測試盒LecithinCholesterolAcyltransferase