PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競(jìng)爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

人腫瘤壞死因子可溶性受體Ⅰ(TNFsR-Ⅰ)ELISA試劑盒α-N-Catenin Antibody100 ul

人肺癌標(biāo)志物DR-70(DR-70TM)ELISA試劑盒Parkin Antibody100 ul

人腫瘤血管生長因子(TAF)ELISA試劑盒 DJ-1 Antibody100 ul

人抗腎小管基底膜抗體(TBM)ELISA試劑盒CD2AP Antibody20 ul

人結(jié)核菌桿抗體IgG(TB-Ab IgG)ELISA試劑盒CD2AP Antibody100 ul

人TU3A蛋白(TU3A)ELISA試劑盒ATGL Antibody100 ul

人色氨酰tRNA合成酶(WARS)ELISA試劑盒LSD1 Antibody100 ul

人胰蛋白酶原Ⅱ(Try-Ⅱ)ELISA試劑盒 Rictor Antibody100 ul
雙?？虏《咎结樂晒舛?/font>PCR試劑盒大鼠CCL27.8-500pg/mllipoteichoic acids

大鼠CCL201.563-100ng/mlLpPLA2|LDL-PLA2|Lp-PLA2|PAF-AH|Phospholipase A2 Group VII|2-acetyl-1-alkylglycerophosphocholine esterase|EC 3.1.1|EC 3.1.1.47|1-alkyl-2-acetylglycerophosphocholine esterase|Group-VIIA phospholipase A2|gVIIA-PLA2|LDL-associated phospholipase A2|LDL-PLA(2)|LDL-PLA2|lipoprotein-associated phospholipase A2|LP-PLA2|PAF acetylhydrolase|PAFAHPAF 2-acylhydrolase|phospholipase A2|group VII(platelet-activating factor acetylhydrolase|plasma)|platelet-activating factor acetylhydrolase

大鼠CCL210.313-20ng/mlLTA4H|EC 3.3.2.6|Leukotriene A(4) hydrolase|leukotriene A4 hydrolase|leukotriene A-4 hydrolase|LTA4|LTA-4 hydrolase

大鼠CCL2415.625-1000pg/mlLTβ

大鼠CCL260.313-20ng/mlLTβR

大鼠CCL31.25-80ng/mllysozyme G

大鼠CCL70.625-40ng/mlM-AChR

大鼠CCL220.313-20ng/mlMAG Ab|MAG|GMA|S MAG|myelin associated glycoprotein

大鼠CD140.156-10ng/mlMAN1A1|Mannosyl-oligosaccharide 1|2-alpha-mannosidase IA|Processing alpha-1|2-mannosidase IA(Alpha-1|2-mannosidase IA)|Man(9)-alpha-mannosidase(Man9-mannosidase)|Mannosidase alpha class 1A member 1

大鼠CD16315.625-1000pg/mlMANF|ARMET|ARP|Arginine-Rich Protein|arginine-rich|mutated in early stage tumors|ARMET|ARP|mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor|Protein ARMET

大鼠CD231.563-100ng/mlMAPK

大鼠CD2662.5-4000pg/mlMCSFR

大鼠CD40L0.156-10ng/mlMCSP|AN2|CSPG4|HMW-MAA|MCSPG|MEL-CSPG|chondroitin sulfate proteoglycan 4|chondroitin sulfate proteoglycan 4(melanoma-associated)|EC 3.6.3|HMW-MAA|MCSPChondroitin sulfate proteoglycan NG2|MCSPGMelanoma chondroitin sulfate proteoglycan|MEL-CSPG|MSK16Melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan|NG2EC 2.7.8

大鼠CINC-17.813-500pg/mlMelatonin

大鼠CINC-2a/b0.313-20ng/mlMFAP4|Microfibril-Associated Glycoprotein 4

98%5g1g南五味子木脂素N4431010antideoxyribonuclease B

L-正纈氨 質(zhì)量規(guī)格：99%,BR L-Norvaline BEL-7405(人肝細(xì)胞)苜蓿中華根瘤菌 Sinorhizobium meliloti

sisalagenin阿托伐醌相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人血管緊張素原(aGT)ELISA試劑盒 0.2ml

PABA(Human paraaminobenzoic acid) ELISA Kit  人對(duì)氨基CAS號(hào)：2608411絲氨醛轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)試盒1gHuman/人Elisa試盒31301287

97%25g5g五脂D55056809antiBullous Pemphigoid 180 antibody

精喹禾靈(分析標(biāo)準(zhǔn)品，98%) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品，98% Quizalofop-p-ethyl 卵黃瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)/EYA培養(yǎng)基基礎(chǔ)/Egg Yolk Agar Medium Base肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng)250克國產(chǎn)/進(jìn)口

Limonin苯磺阿曲庫銨標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人解整合素樣金屬蛋白酶10(ADAM10)ELISA試劑盒 0.2ml

LPA(Human Lphenylalanine) ELISA Kit  人氨CAS號(hào)：2608411甘氨甜菜堿檢測(cè)試盒5gHuman/人Elisa試盒31301458

AMCAX 琥珀酰亞 5mg

解毒喹(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品 Cloquintocet-mexyl

CREB1 (cAMP responsive element binding protein1)  環(huán)腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（抗原）進(jìn)口、分裝脯氨檢測(cè)試盒25gHuman/人Elisa試盒49845332

AMCA 5mg

 Saos-2(人骨肉瘤細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

phosphoCREB1   化環(huán)腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（多肽）進(jìn)口、原裝3羥3戊二單酰輔酶Ａ還原酶檢測(cè)試盒5gHuman/人Elisa試盒49845332

磺基羅丹明101尸磺5mg

敵草隆(99%) 質(zhì)量規(guī)格：0.99 Diuron

ADRA2 peptide  上腺素能受體2抗原現(xiàn)貨供應(yīng)細(xì)胞色素P4502D6檢測(cè)試盒100gHuman/人Elisa試盒49845332
實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。