熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

小鼠碳酸酐酶2(CA-2)ELISA試劑盒MSR1 (D8K4E) Rabbit mAb100 ul

小鼠鈣結(jié)合蛋白(CR)ELISA試劑盒 CD151 Antibody100 ul

小鼠牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)ELISA試劑盒CYP17A1 Antibody1 Kit

小鼠鈣通道阻滯劑(CCB)ELISA試劑盒 One-Carbon Metabolism Antibody Sampler Kit100 ul

小鼠降鈣素(CT)ELISA試劑盒CDK8 (D6M3J) Rabbit mAb100 ul

小鼠降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)ELISA試劑盒Nectin-4/PVRL4 Antibody100μl

小鼠腫瘤標(biāo)志物(CA724)ELISA試劑盒CMTM4 Antibody500 ul

小鼠溴脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)ELISA試劑盒 SimpleChIP? Mouse USP31 Promoter Primers100 ul
東方蜜蜂微孢子蟲探針法熒光定量PCR試劑盒人白介素6(IL-6) ELISA KIT 0.156-10ng/mlUBQLN1|DA41|DSK2|PLIC-1|UBQLN1|UBQN|XDRP1|DA41FLJ90054|DSK2|hPLIC-1|PLIC1|PLIC-1UBQN|Protein linking IAP with cytoskeleton 1|ubiquilin 1|ubiquilin-1|XDRP1

人的白介素-5(IL-5)0.312-20ng/mlNFKB2|Oncogene Lyt-10(Lyt10)|Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 2|Lymphocyte translocation chromosome 10 protein|DNA-binding factor KBF2|H2TF1|LYT10

人白介素4(IL-4)7.813-500pg/mlAPOC4(Apolipoprotein C4)|Apo-CIV|ApoC-IV|Apolipoprotein C-IV

人白介素3(IL-3)78-5000pg/mlCCDC82|Coiled-coil domain-containing protein 82|HT025

人白介素2可溶性受體β鏈(IL-2sRβ )0.312-20ng/mlHMGN1|HMG14|High mobility group nucleosome-binding domain-containing protein 1|high-mobility group(nonhistone chromosomal) protein 14|high-mobility group nucleosome binding 1|high-mobility group nucleosome binding domain 1||non-histone chromosomal protein HMG-14|nonhistone chromosomal protein HMG-14

人白介素2可溶性受體α鏈(CD25) (IL-2sRα )0.312-20ng/mlIGIP

人白介素2(IL-2)1.56-100ng/mlSTS|Steryl-sulfate sulfohydrolase|Arylsulfatase C(ASC)|Steroid sulfatase|ARSC1

人白介素1α (IL-1α )0.313-20ng/mlS100A2|CAN19|S100L|CAN19protein S100-A2|S100 calcium binding protein A2|S100 calcium-binding protein A2Protein S-100L|S100L

人白介素1可溶性受體Ⅱ(IL-1sRⅡ)78-5000pg/mlCCT8L1P

人白介素1可溶性受體I(IL-1sRI)15.6-1000pg/mlHMMR|Intracellular hyaluronic acid-binding protein|Receptor for hyaluronan-mediated motility|CD168|IHABP|RHAMM

人白介素1α (IL-1α )0.156-10ng/mlDUOX2|Thyroid oxidase 2|NADPH thyroid oxidase 2|NADPH oxidase|peroxidase DUOX2|NADH|NADPH thyroid oxidase p138-tox|p138 thyroid oxidase|Large NOX 2|Long NOX 2|LNOX2|THOX2

人白介素1可溶性受體Ⅱ(IL-1sRⅡ)78-5000pg/mlITGA9|ITGA4L|RLC-alpha|ALPHA-RLC|integrin alpha-9|Integrin alpha-RLC|integrin|alpha 9|ITGA4L|RLC

人白介素1可溶性受體Ⅰ(IL-1sRⅠ)78.125-5000pg/mlRHOA|Rho cDNA clone 12|h12||ARH12|ARHA

人白介素-16(IL-16)78-5000pg/mlADC|ODC-paralogue|ODC-p|Ornithine decarboxylase-like protein|ARGDC

人白介素-15(IL-15)0.312-20ng/mlNRTN|NTN

Asiatic acid型肝炎病毒表面抗體檢測試劑盒20mg

DL-正纈氨 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR DL-Norvaline 苜蓿中華根瘤菌 Sinorhizobium meliloti苜蓿中華根瘤菌 Sinorhizobium meliloti

Toosendanin阿立唑相關(guān)物質(zhì)F標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人ATP-結(jié)合盒亞家族B成員5 (ABCB5)ELISA試劑盒 0.2ml

人Flt3KNDC1  腦蛋白9抗體規(guī)格:96T/48TArticaine Related Compound E規(guī)格:10mgP糖蛋白;滲透性糖蛋白檢測試盒10mg人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，U87 MG細(xì)胞1x10^6cells

 Madecassoside型肝炎病毒核心抗體檢測試劑盒250mg

無脂肪牛血清白蛋白 質(zhì)量規(guī)格：>98%,分子生物學(xué)級 Albumin, from bovine pH 7.0 Fatty free 大鼠胎兒真皮成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基100mL

2,3,5,6-Tetramethylpyrazine阿立唑相關(guān)物質(zhì)G標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人果糖-二醛縮酶C(ALDOC)ELISA試劑盒 0.2ml

人Flt3配體(Flt3 ligand)KCC2/SLC12A5  神經(jīng)細(xì)胞鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白抗體規(guī)格:96T/48TAscorbic Acid (Vitamin C)規(guī)格:200mgP物質(zhì)檢測試盒5mg人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，U118MG細(xì)胞1x10^6cells

98%5g5g葡萄糖化酶betacrosslaps

醋棉酚;Gossypol-acetic 訂購|咨詢 規(guī)格： 20mg ELISA Kit for Human Appetite-regulating hormone小鼠賴氨酰氧化酶(LOX)ELISA試劑盒，英文名：LOX ELISA Kit

IKI3 family protein  現(xiàn)貨供應(yīng)成纖維細(xì)胞生長子23的C端裂解片段檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒496151

97%25g25g葡萄糖化酶propanediol

抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=2%) 質(zhì)量規(guī)格：100μg/ml,u=2% Imazalil solution

ILK1 (Integrinlinked protein kinase 1)  整合素連接激酶1特價促銷去?；窼irtuin6檢測試盒100gHuman/人Elisa試盒496151

7氨基4三基香豆素；香豆素1515mg

 大鼠卵巢上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基100mL

Aromatase  芳香化酶（抗原）進(jìn)口、分裝免疫球蛋白G2b檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒496151