PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

小鼠γ氨基丁酸(GABA)ELISA試劑盒Di-Methyl-Histone H3 (Lys36) (C75H12) Rabbit mAb (PE Conjugate)100 ul

小鼠游離三碘甲狀腺原氨酸(Free-T3)ELISA試劑盒ALKBH7 Antibody100 ul

小鼠游離甲狀腺素(FT4)ELISA試劑盒CD40 Ligand (D5J9Y) Rabbit mAb100 ul

小鼠游離睪酮(F-TESTO)ELISA試劑盒BCL9 Antibody100 ul

小鼠游離脂肪酸(FFA)ELISA試劑盒Akt3 (E1Z3T) Rabbit mAb100 ul

小鼠趨化因子(fractalkine/CX3CL1) ELISA試劑盒TRIM27 (D5S4O) Rabbit mAb100 ul

小鼠卵泡抑素(FS)ELISA試劑盒APC8 (D5O2D) Rabbit mAb100 ul

小鼠促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒NLRP3 (D4D8T) Rabbit mAb100 ul
休斯新孢子蟲探針法熒光定量PCR試劑盒紫蘇子對照藥材0.312-20ng/mlTARBP2|RISC-loading complex subunit TARBP2|TAR RNA-binding protein 2|Trans-activation-responsive RNA-binding protein

紫草對照藥材0.312-20ng/mlTBC1D1|TBC1 domain family member 1

紫菀78-5000pg/mlTBPL1|TATA box-binding protein-like protein 1(TBP-like protein 1)|TBP-related protein|TBP-like factor|TATA box-binding protein-related factor 2(TBP-related factor 2)|21 kDa TBP-like protein|Second TBP of unique DNA protein(STUD)|

澤瀉0.156-10ng/mlDRAM1|DNA damage-regulated autophagy modulator protein 1|Damage-regulated autophagy modulator

枳實(shí)對照藥材0.312-20ng/mlMBOAT4|OACT4|EC 2.3.1.-|ghrelin O-acyltransferase|membrane bound O-acyltransferase domain containing 蛤蚧對照藥材0.313-20ng/mlATP13A2|Probable cation-transporting ATPase 13A2

西洋參對照藥材0.156-10ng/mlDNAJC27|DnaJ homolog subfamily C member 27|Rab and DnaJ domain-containing protein|

紫蘇葉對照藥材15.625-1000pg/mlMSMB|PSP94|IGBF|MSPB|PIP|PN44|PRPS|PSP57

花椒對照藥材0.78-50ng/mlRSAD2|Radical S-adenosyl methionine domain-containing protein 2|Virus inhibitory protein|endoplasmic reticulum-associated|interferon-inducible|Cytomegalovirus-induced gene 5 protein|Viperin

蓮子對照藥材0.156-10ng/mlTMEM132D|Transmembrane protein 132D|Mature oligodendrocytes transmembrane protein(Mature OL transmembrane protein)

豬苓對照藥材0.156-10ng/mlNOTCH3|CADASIL|CASILneurogenic locus notch homolog protein 3|Notch(Drosophila) homolog 3|notch 3Notch homolog 3(Drosophila)|Notch homolog 3

半枝蓮對照藥材0.156-10ng/mlPSTK|L-seryl-tRNA(Sec) kinase|O-phosphoseryl-tRNA(Sec) kinase|

白芍對照藥材0.156-10ng/mlNAT8L|N-acetylaspartate synthetase(NAA synthetase)|Camello-like protein 3|N-acetyltransferase 8-like protein

生地黃對照藥材0.156-10ng/mlTMEM126A

≥97%25g25g阿嗎定84162Keratin, type II cytoskeletal 1b

鹽咪達(dá)普利（標(biāo)準(zhǔn)品） 質(zhì)量規(guī)格：HPLC法含量測定 Imidapril Hydrochloride 熱帶假絲酵母 Candida tropicalisSwiss albion小鼠胚胎成纖維細(xì)胞

血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 GALNT2 / GalNAc-T2 蛋白 (His 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)250(g)

human similar to cDNA sequence BC027382 ELISA Kit  人類似cDNA順序BC027382CAS號(hào)：844烯氧化酶檢測試盒150kuHuman/人Elisa試盒309886

≥97%100g1g利血那明69004042glial cell linederived neurotrophic factor

alpha-亞麻(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：≥98.5%(GC),分析標(biāo)準(zhǔn)品 Linolenic acid 異常漢遜酵母 Hansenula anomala球菌脂亞種 Lactococcus lactis subsp. cremoris

血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 COL5A2 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷250(g)

human similar to RIKEN cDNA 4931408D14 gene ELISA kit  人類似RIKEN cDNA 4931408D14 基CAS號(hào)：81756酯酶D檢測試盒100gHuman/人Elisa試盒30992291

97%25mg100g木瓜蛋白酶laminin β3

異隆;純品型;標(biāo)準(zhǔn)品;有證書 訂購|咨詢 規(guī)格： 0.1g 肌動(dòng)蛋白解聚因子19抗體 ENPP3 ELISA Kit 外核苷焦酶/二酯酶3(ENPP3)ELISA試劑盒

2,4D/KLH(2,4Dichlorophenoxyacetic acid)  2，4二氧偶聯(lián)血藍(lán)蛋白現(xiàn)貨供應(yīng)脫腳病病檢測試盒1gHuman/人Elisa試盒4949137

97%100mg5g木瓜蛋白酶laminin β2

多潘立  英文名稱：Domperidone   保存：-20℃   規(guī)格：100mg 化G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子19抗體

2,4D/BSA  2，4二氧偶聯(lián)牛血清白蛋白特價(jià)促銷單核細(xì)胞趨化蛋白2檢測試盒1gHuman/人Elisa試盒4949444

97%5g25g菠蘿蛋白酶laminin β1

三七皂苷FC 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢 人紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)ELISA試劑盒人96T78-5000 pg/mL小鼠突觸極蛋白2(SYNPO2)ELISA試劑盒，英文名：SYNPO2 ELISA Kit

Akt/PKB  蛋白激酶B（抗原）進(jìn)口、分裝白三烯E4檢測試盒1gHuman/人Elisa試盒4949444
實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。