定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

小鼠乙型肝炎核心抗體(HBcAb)ELISA試劑盒 PD-L1 (E1L3N?) XP? Rabbit mAb (Alexa Fluor? 647 Conjugate)100 ul

小鼠肝脂酶(HL)ELISA試劑盒 mTOR (7C10) Rabbit mAb (PE Conjugate)100 ul

小鼠血紅素氧合酶2(HO-2)ELISA試劑盒DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb (Binds to same epitope as Sigma's Anti-FLAG? M2 Antibody) (Alexa Fluor? 488 Conjugate)100 ul

小鼠血紅素氧合酶1(HO-1)ELISA試劑盒DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb (Binds to same epitope as Sigma's Anti-FLAG? M2 Antibody) (Alexa Fluor? 647 Conjugate)100 ul

小鼠幽門螺旋菌IgG(Hp-IgG)ELISA試劑盒 DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb (Binds to same epitope as Sigma's Anti-FLAG? M2 Antibody) (Pacific Blue? Conjugate)100 ul

小鼠熱休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)ELISA試劑盒Atg2A Antibody100 ul

小鼠熱休克蛋白90(HSP-90)ELISA試劑盒Phospho-Tau (Ser416) (D7U2P) Rabbit mAb20 ul

小鼠熱休克蛋白70(HSP-70)ELISA試劑盒Phospho-Tau (Ser416) (D7U2P) Rabbit mAb100 ul
微黃細(xì)頸線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒沒藥對照藥材0.312-20ng/mlKCNB2|Voltage-gated potassium channel subunit Kv2.2

麻黃根對照藥材0.156-10ng/mlUBR1|Ubiquitin-protein ligase E3-alpha-I|N-recognin-1|E3 ubiquitin-protein ligase UBR1|N-recognin-1

綿馬貫眾對照藥材0.78-50ng/mlTK2|Mt-TK|EC 2.7.1.21|thymidine kinase 1 soluble isoform|thymidine kinase 1|soluble|thymidine kinase|cytosolic|thymidine kinase-1

綿萆薢對照藥材0.156-10ng/mlHUWE1|Upstream regulatory element-binding protein 1|URE-B1|URE-binding protein 1|Mcl-1 ubiquitin ligase E3|Large structure of UREB1|LASU1|Homologous to E6AP carboxyl terminus homologous protein 9|HectH9|ARF-binding protein 1|ARF-BP1|HECT|UBA and WWE domain-containing protein 1

墨旱蓮對照藥材0.312-20ng/mlPDCD4|H731|nuclear antigen H731|Neoplastic transformation inhibitor protein|Nuclear antigen H731-like|programmed cell death 4(neoplastic transformation inhibitor)|programmed cell death protein 4|Protein 197|15a

牛蒡子對照藥材0.312-20ng/mlEGFLAM|Agrin-like protein|EGF-like|fibronectin type-III and laminin G-like domain-containing protein|AGRINL|AGRNL

牛膝對照藥材0.156-10ng/mlSNAI2|Neural crest transcription factor Slug|Protein snail homolog 2|SLUG|SLUGH

南五味子對照藥材0.156-10ng/mlNOTCH2|AGS2|hN2|Notch(Drosophila) homolog 2|notch 2Notch homolog 2(Drosophila)|Notch homolog 2

平貝母對照藥材0.312-20ng/mlNOTCH4|INT3|Notch 4|hNotch4

枇杷葉對照藥材0.156-10ng/mlAKR1C4|3-alpha-HSD|AKR1C4|CDR|CHDR|DD4|HAKRA|C11|DD-4

佩蘭對照藥材0.156-10ng/mlATG12|APG12|FBR93|HAPG12|Apg12(autophagy 12|S. cerevisiae)-like|APG12 autophagy 12-like(S. cerevisiae)|APG12HAPG12|APG12-like|ATG12 autophagy related 12 homolog(S. cerevisiae)|Autophagy-related protein 12|FBR93

蒲公英15.6-1000pg/mlFOLR2|beta-HFR|FR-beta|FR-P3|BETA-HFR|FBP|Folate receptor 2|folate receptor 2(fetal)|folate receptor|beta|Folate receptor|fetal|placental|folate-binding protein|fetal|placental|FR-BETA|Placental folate-binding protein

千里光對照藥材0.156-10ng/mlB4GALT5|Beta-1|4-GalTase 5|Beta4Gal-T5|b4Gal-T5|UDP-galactose:beta-N-acetylglucosamine beta-1|4-galactosyltransferase 5|Beta-1|4-GalT II|UDP-Gal:beta-GlcNAc beta-1|4-galactosyltransferase 5

千年健對照藥材78-5000pg/mlCBLB|Signal transduction protein CBL-B|SH3-binding protein CBL-B|Casitas B-lineage lymphoma proto-oncogene b|RING finger protein 56

芡實(shí)對照藥材0.78-50ng/mlCAMKK2|CaM-KK 2|CaM-kinase kinase 2|CaMKK 2|Calcium|calmodulin-dependent protein kinase kinase beta|CaM-KK beta|CaM-kinase kinase beta|CaMKK beta

Sesamin異質(zhì)性胞核核糖核蛋白I檢測試劑盒20mg

染料木素/金雀異黃 質(zhì)量規(guī)格：≥98%,BR Genistein

Deoxycholic acid地蒽標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人腺苷受體A1(Adenosine receptor A1)ELISA試劑盒 0.2ml

Ly6a(Human lymphocyte antigen 6 complex locus A) ELISA Kit  人淋細(xì)胞抗原6復(fù)合物基座ACAS號：10405024 ATP合成酶檢測試盒10gHuman/人Elisa試盒3096579

Deoxycholic acid異質(zhì)性胞核核糖核蛋白K檢測試劑盒20mg

 SD-39瓊脂/SD-39 Agar濾膜法大腸桿菌O157的分離培養(yǎng)250克國產(chǎn)/進(jìn)口

Sesamin安替比林標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人腺苷受體A2a(Adenosine receptor A2a)ELISA試劑盒 0.2ml

EAR1(Human eosinophilassociated ribonuclease A family member 1) ELISA KIT  人嗜性白血球相關(guān)之RNA水解酵素家族成員1CAS號：104010379漆酶檢測試盒1gHuman/人Elisa試盒3096579

黃獨(dú)素；黃藥子素BFluo4五鹽5mg

 亮氨酰氨基肽酶(LAP)重組蛋白英文名稱：Recombinant Leucine Aminopeptidase (LAP)

色氨檢測試盒20mg低密度脂蛋白檢測試盒l(wèi)owdensitylipoproteincholesterol

木蝴蝶素A70βD葡萄糖醛苷; 木蝴蝶素A7葡萄糖醛苷；千層紙素7葡萄糖醛苷Fluo4五鈉鹽5mg

三唑(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>97%(HPLC)) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品,>97%(HPLC) Triazophos

高純，PC=90%蛋白聚糖檢測試盒20mg低密度脂蛋白膽固醇檢測試盒hypoxiainduciblefactor1α

漢黃芩甙鈣熒光探針Fluo4, AM（5mM 無水DMSO溶液）5mg

 細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞關(guān)聯(lián)抗原4(CTLA4)重組蛋白英文名稱：Recombinant Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Antigen 4 (CTLA4)

雌激素受體β檢測試盒20mg低氧誘導(dǎo)子1α檢測試盒paraoxonase1