PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

小鼠胰島素樣生長因子2(IGF-2)ELISA試劑盒β-Amyloid (1-42 Specific) (D9A3A) Rabbit mAb20 ul

小鼠胰島素樣生長因子1(IGF-1)ELISA試劑盒β-Amyloid (1-42 Specific) (D9A3A) Rabbit mAb100 ul

小鼠胰島素(INS)ELISA試劑盒β-Amyloid (pE3 Peptide) (D5N5H) Rabbit mAb20 ul

小鼠胰島素受體β(ISR-β)ELISA試劑盒β-Amyloid (pE3 Peptide) (D5N5H) Rabbit mAb100 ul

小鼠胰島素自身抗體(IAA)ELISA試劑盒CDCA2 (D7T4P) Rabbit mAb100 ul

小鼠抑制素A(INH-A)ELISA試劑盒CENP-E Antibody100 ul

小鼠抑制素B(INH-B)ELISA試劑盒Phospho-Rad18 (Ser403) (D2T6W) Rabbit mAb100 ul

小鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)ELISA試劑盒IRGM Antibody (Rodent Specific)100 ul
畸形細(xì)頸線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒佛手對照藥材15.625-1000pg/mlPRDX1|NKEF-A|PRDX1|PRX1|TDPX2|Natural killer cell-enhancing factor A|natural killer-enhancing factor A|NKEFA|NKEF-A|PAG|PAGAMSP23|PAGB|peroxiredoxin 1|peroxiredoxin-1|proliferation-associated gene A|Proliferation-associated gene protein|PRX1|PRXI|TDPX2|Thioredoxin peroxidase 2|Thioredoxin-dependent peroxide reductase 2

茯苓對照藥材15.6-1000pg/mlITGB1|CD29|CD29 antigen|Fibronectin receptor subunit beta|FNRBVLAB|GPIIA|integrin beta-1|integrin VLA-4 beta kinase|PSCTK2

龜甲對照藥材0.312-20ng/mlLPCAT2|LPC acyltransferase 2|LPCAT-2|LysoPC acyltransferase 2|Lysophosphatidic acid acyltransferase alpha|LPAAT-alpha|Acetyl-CoA|lyso-PAF acetyltransferase

干姜對照藥材0.312-20ng/mlTPH2|Neuronal tryptophan hydroxylase|Tryptophan 5-monooxygenase 2|

廣金錢草對照藥材0.312-20ng/mlTPH1|TPRH|indoleacetic acid-5-hydroxylase|L-tryptophan hydroxylase|tryptophan 5-hydroxylase 1|Tryptophan 5-monooxygenase 1|tryptophan hydroxylase(tryptophan 5-monooxygenase)|tryptophan hydroxylase 1

甘松對照藥材78-5000pg/mlNDST2|bifunctional heparan sulfate N-deacetylase|N-sulfotransferase 2|Glucosaminyl N-deacetylase|N-sulfotransferase 2|N-deacetylase|N-sulfotransferase(heparan glucosaminyl) 2|NDST-2|N-heparan sulfate sulfotransferase 2|N-HSST 2|NST2

甘草對照藥材62.5-4000pg/mlAPLN(Apelin)|APEL|XNPEP2|APJ endogenous ligand

甘遂對照藥材0.312-20ng/mlGAS1|GAS-1|growth arrest-specific 1|Growth arrest-specific gene-1|growth arrest-specific protein 1

瓜蔞皮對照藥材3.125-200ng/mlMASP2|MBL-associated serine protease 2|Mannose-binding protein-associated serine protease 2|MASP-2

狗脊對照藥材0.156-10ng/mlTFR2|HFE3|TFRC2|HFE3transferrin receptor protein 2|TFRC2|transferrin receptor 2

枸杞子對照藥材31.25-2000pg/mlGP5|CD42d|GP5|GPV|platelet glycoprotein V|CD42d|glycoprotein V(platelet)|GPV

高良姜對照藥材1.56-100ng/mlAZGP1|ZA2G|ZNGP1|alpha-2-glycoprotein 1|zinc|alpha-2-glycoprotein 1|zinc-binding|ZA2G|ZAGzn-alpha-2-GP|zinc|zinc-alpha-2-glycoprotein|zn-alpha-2-glycoprotein|ZNGP1

葛根對照藥材0.156-10ng/mlFABP6|Gastrotropin|I-15P|IBABP|I-BAP|ILBP|ILBP3|ILLBP|fatty acid binding protein 6|ileal|Fatty acid-binding protein 6|gastrotropin|I-15PIntestinal 15 kDa protein|I-BABPIntestinal bile acid-binding protein|I-BALB|I-BAP|ILBP3|ILBPGT|ileal bile acid binding protein|ILLBPIleal lipid-binding protein|illeal lipid-binding protein

Magnolol異質(zhì)性胞核核糖核蛋白A3檢測試劑盒20mg

玉米黃質(zhì) 質(zhì)量規(guī)格：>40% Zeaxanthin

Cantharidin醋阿奈他相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人腺苷高半胱(AdoHcyase)ELISA試劑盒 0.2ml

CLEC4E(Human Ctype lectin domain family 4 member e) ELISA Kit  人C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員ECAS號：104286024 生長激素檢測試盒10gHuman/人Elisa試盒3096568

Hordenine異質(zhì)性胞核核糖核蛋白C檢測試劑盒20mg

 小鼠白血病細(xì)胞英文名稱：L1210

Norcantharidin茴香標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人犬尿氨/線粒體氨基已二轉(zhuǎn)氨酶α(AADAT)ELISA試劑盒 0.2ml

人白介素13(IL13)REG1β/REG1 beta  胰島細(xì)胞再生子β抗體規(guī)格:96T/48TApomorphine Hydrochloride規(guī)格:1g上腺髓質(zhì)前體中段肽檢測試盒20mg人類星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞，U251細(xì)胞1x10^6cells

97%500g100g菠蘿蛋白酶coronavirus IgM

癸甲酯(分析標(biāo)準(zhǔn)品,用于環(huán)境分析,≥99.5%(GC)) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品,用于環(huán)境分析,≥99.5%(GC) Methyl decanoate

優(yōu)黑素檢測試盒20mg蛋白多糖檢測試盒ProteinkinaseA

97%25g5g菠蘿蛋白酶coronavirus IgG

 XLD瓊脂培養(yǎng)基 規(guī)格： 250g 用途： 用于臨床標(biāo)本及食品中志賀氏、沙門氏菌選擇性分離。（GB4789.4-2008，F(xiàn)DA BAM chapter5，ISO 657...

Sterile Defidrinated Mouse BloodBR雌1檢測試盒20mg蛋白激酶A檢測試盒ProteinkinaseB

97%100g25g菠蘿蛋白酶periostin

十二甲酯(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品 Methyl laurate

Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶1檢測試盒20mg蛋白激酶B檢測試盒ProteinKinaseC
實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。