熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

小鼠白介素3(IL-3)ELISA試劑盒MST1 (D8B9Q) Rabbit mAb100 ul

小鼠白介素27(IL-27)ELISA試劑盒Phospho-CD79A (Tyr182) (D1B9) Rabbit mAb (PE Conjugate)100 ul

小鼠白介素23(IL-23)ELISA試劑盒TBC1D7 (D8K1Y) Rabbit mAb100 ul

小鼠白介素2(IL-2)ELISA試劑盒MED26 (D4B1X) Rabbit mAb100 ul

小鼠白介素1β (IL-1β)ELISA試劑盒Phospho-NuMA (Thr2055) Antibody100 ul

小鼠白介素1α(IL-1α)ELISA試劑盒FoxO1 (D7C1H) Mouse mAb20 ul

小鼠白介素18(IL-18)ELISA試劑盒FoxO1 (D7C1H) Mouse mAb100 ul

小鼠白介素16(IL-16)ELISA試劑盒Spry2 (D3G1A) Rabbit mAb100 ul
腦膜炎奈瑟菌探針法熒光定量PCR試劑盒百合對照藥材78.125-5000pg/mlCXCR4|Chemokine C-X-C-Motif Receptor|Stromal cell-derived factor 1 receptor(SDF-1 receptor)|Leukocyte-derived seven transmembrane domain receptor(LESTR)|Fusin|LCR1|CD184|Fusin|chemokine(C-X-C motif) receptor 4|C-X-C chemokine receptor type 4|CXC-R4||D2S201ESDF-1 receptor|FB22|Fusin|HM89NPYRL|HSY3RR|LAP3|LCR1|LESTRCD184 antigen|Leukocyte-derived seven transmembrane domain receptor|lipopolysaccharide-associated protein 3|neuropeptide Y receptor Y3|NPY3RWHIM|NPYR|NPYY3R|seven transmembrane helix receptor|seven-transmembrane-segment receptor|spleen|Stromal cell-derived factor 1 recepto

南板藍(lán)根對照藥材3.125-200ng/mlAMY2|Pancreatic alpha-amylase|1|4-alpha-D-glucan glucanohydrolase

薄荷對照藥材0.156-10ng/mlDDAH2|DDAH|DDAHII|G6a|NG30|S-phase protein|Protein G6a|DDAHII|Dimethylargininase-2

柏子仁對照藥材0.625-40ng/mlHIG2|C7orf68|FLJ21076|HIG-2|HIG2.

川木香對照藥材15.625-1000pg/mlNES|FLJ21841|nestin

川木通對照藥材0.312-20ng/mlSYP|Major synaptic vesicle protein p38|SYP|Major synaptic vesicle protein p38|MRX|MRXSYP|synaptophysin

川牛膝對照藥材0.156-10ng/mlBST1|CD157|ADP-ribosyl cyclase 2|Cyclic ADP-ribose hydrolase 2|BP-3|BST1|cADPr hydrolase 2|CD157|ADP-ribosyl cyclase 2|Bone marrow stromal antigen 1|bone marrow stromal cell antigen 1|BST-1|cADPr hydrolase 2|CD157|CD157 antigen|Cyclic ADP-ribose hydrolase 2|NAD(+) nucleosidase

川芎對照藥材31.25-2000pg/mlPIICP|Chondrocalcin

川射干對照藥材93.75-6000pg/mlPIINP

川楝子對照藥材0.312-20ng/mlDCP|PIVKA-Ⅱ

蒼耳子對照藥材1.57-100ng/mlWNT3A|MGC119418|MGC119419|MGC119420|protein Wnt-3a|wingless-type MMTV integration site family|member 3A

刺五加對照藥材0.312-20ng/mlSMAD2|JV18|MADH2|MADR2|JV18-1|hMAD-2|hSMAD2|SMAD family member 2(SMAD 2|Smad2|hSMAD2)|JV18-1|Mad-related protein 2(hMAD-2)|

垂盆草對照藥材0.625-40ng/mlSmad3|MADH3|JV15-2|SMAD family member 3|hMAD-3|hSMAD3|MAD homolog 3|mad protein homolog|MAD|mothers against decapentaplegic homolog 3|MAD|mothers against decapentaplegic homolog 3(Drosophila)|mad3|Mad3|MADH3mad homolog JV15-2|mothers against decapentaplegic homolog 3|Mothers against DPP homolog 3|SMA- and MAD-related protein 3|SMAD family member 3HSPC193|SMAD|mothers against DPP homolog 3|SMAD|mothers against DPP homolog 3(Drosophila)|Smad3

重樓對照藥材0.156-10ng/mlPPRC1|PGC-1-related coactivator(PRC)

柴胡對照藥材0.156-10ng/mlCD24|CD24A|FLJ22950|FLJ43543|MGC75043|Small cell lung carcinoma cluster 4 antigen|CD24A|CD24 antigen|CD24 antigen(small cell lung carcinoma cluster 4 antigen)|CD24 molecule|CD24Asignal transducer CD24|Small cell lung carcinoma cluster 4 antigen

99%5g25g1羥基2基蒽醌7365459alkaline phosphatase

利莫那班羧 質(zhì)量規(guī)格：>98% Rimonabant carboxylic acid

氨基端前心鈉肽(NT-ProANP)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 BPIFB1 / LPLUNC1 蛋白 (His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷250(g)

MYD88(Human myeloid differentiation primary response gene 88) ELISA Kit  人髓樣分化子初次應(yīng)答基88CAS號：104517966 鯊烯合酶檢測試盒100gHuman/人Elisa試盒3095952

98%250mg100g1羥基2基蒽醌1132612basic fibroblast growth factor 9

 人黑色素瘤細(xì)胞英文名稱：MV3

氨基端前鈉素(NT-ProBNP)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 IL17BR / IL17RB / IL-17 Receptor B 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)250(g)

Ifi205(Human interferon activated gene 205) ELISA Kit  人干擾素活化基205CAS號：104376796抗性淀粉檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒30964002

長梗冬青苷; 具棲冬青甙; 長梗冬青甙鈣熒光探針Fluo3, AM  5mg

尼可占替諾（煙占替諾）  英文名稱：Xantinol nicotinate (xanthinol nicotinate)   保存：-20℃   規(guī)格：100mg 環(huán)指蛋白180抗體

AAT(Alpha1Antitiypsin)  α1抗胰蛋白酶(抗原）特價(jià)促銷谷氨合成酶檢測試盒100gHuman/人Elisa試盒4940118

棘苷鈣熒光探針Fluo3, AM  5mg

金石蠶苷  英文名稱：Jinshi silkworm glycoside   保存：-20℃   規(guī)格：HPLC≥98% 20mg/支 小細(xì)胞跨膜糖化蛋白抗體

FPP(Fertilization Promoting Peptide)  受精促進(jìn)肽進(jìn)口、分裝趨化子CC基元配體15檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒4940118

5,6,7,3＇,4＇五基黃BAPTA四鈉鹽5mg

植鈉 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR Phytic acid dodecasodium salt hydrate 3% NaC1鳥氨脫羧酶發(fā)酵管BR20支國產(chǎn)/進(jìn)口

多肽產(chǎn)品  多肽產(chǎn)品進(jìn)口、原裝L乳脫氫酶A鏈檢測試盒500gHuman/人Elisa試盒4940390