定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

豬孕激素/孕酮(PROG)ELISA試劑盒AEBP2 (D7C6X) Rabbit mAb100 ul

豬Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢNT)ELISA試劑盒p70 S6 Kinase 2 Antibody300 ul

豬血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)ELISA試劑盒SignalSilence? OTULIN siRNA I100 ul

豬血小板活化因子(PAF)ELISA試劑盒Spinophilin (E1E7R) Rabbit mAb100 ul

豬纖溶酶原激活物抑制因子(PAI)ELISA試劑盒Twinfilin-1 (D7C6J) Rabbit mAb100 ul

豬纖溶酶原激活物抑制因子1(PAI-1)ELISA試劑盒Phospho-Syk (Ser297) Antibody100 ul

豬磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(pERK)ELISA試劑盒Phospho-GEF-H1 (Ser886) (E1L6D) Rabbit mAb100 ul

豬氧化低密度脂蛋白(OxLDL)ELISA試劑盒CDK5 (D1F7M) Rabbit mAb100 ul
堪薩斯分枝桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒竹葉香附素A0.156-10ng/mlMAT2A(S-adenosylmethionine synthase isoform type-2)|AMS2|MATA2|MAT-II|AdoMet synthase 2|Methionine adenosyltransferase 2|Methionine adenosyltransferase II

紫花前胡素0.156-10ng/mlAHCY(Adenosylhomocysteinase)|AdoHcyase|SAHH|S-adenosylhomocysteine hydrolase|S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase

紫杉葉素0.313-20ng/mlA LAP|ALAP|Aminopeptidase PILS|APPILS|ARTS 1|ARTS1|ERAAP|ERAAP1|ERAP1|KIAA0525|PILS AP|PILSAP

總銀杏酸(C13:0,C15:1,C17:1)0.156-10ng/mlPMP22|GAS3|PMP-22|GAS-3|Growth arrest-specific protein 3

總銀杏酸

(C13:0,C15:1,C17:2,C15:0,C17:1)0.781-50ng/mlIAA(Insulin Autoantibodies)

睡茄素A0.156-10ng/mlSCGB2A2|MGB1|UGB2|Mammaglobin-1|Secretoglobin family 2A member 2

睡茄素B0.156-10ng/mlERRFI1|GENE 33|MIG 6|MIG6|RALT

2-羥基檸檬酸三鉀0.156-10ng/mlTYROBP(TYRO protein tyrosine kinase-binding protein)|DAP12|KARAP|PLOSL|DNAX-activation protein 12|PLO-SL|KAR-associated protein|killer activating receptor associated protein|Killer-activating receptor-associated protein|TYRO protein tyrosine kinase binding protein

1,2-二羥基-1,2,3-丙烷三甲酸0.156-10ng/mlPEBP1|HCNPpp|Neuropolypeptide h3|PBP|PEBP-1|HCNP|hippocampal cholinergic neurostimulating peptide|Neuropolypeptide h3|phosphatidylethanolamine binding protein 1|prostatic binding protein|Prostatic-binding protein|Raf kinase inhibitory protein|RKIPRaf kinase inhibitor protein

2-羥基檸檬酸0.156-10ng/mlSLC45A1|DNB5|PAST-A|DNb-5|Deleted in neuroblastoma 5 protein|Solute carrier family 45 member 1

3-乙?；?BETA-乳香酸0.156-10ng/mlAlpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase FTO|Fat mass and obesity-associated protein|U6 small nuclear RNA (2'-O-methyladenosine-N(6)-)-demethylase FTO|U6 small nuclear RNA N(6)-methyladenosine-demethylase FTO|mRNA (2'-O-methyladenosine-N(6)-)-demethylase FTO|m6A(m)-demethylase FTO|mRNA N(6)-methyladenosine demethylase FTO|tRNA N1-methyl adenine demethylase FTO|FTO|KIAA1752

D,L-1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯0.156-10ng/mlSLC30A3|Zinc transporter 3|ZnT-3|Solute carrier family 30 member 3

阿江欖仁酸0.313-20ng/mlPGR|Progesterone Receptor|Nuclear receptor subfamily 3 group C member 3|PR|NR3C3

倍酸甲酯15.6-1000pg/mlPSEN2|Presenilin-2|PS-2|STM-2|E5-1|AD3LP|AD5|AD4|PSNL2

蠶豆苷0.78-50ng/mlARSD|Arylsulfatase D|ASD

Oleanolic acid載脂蛋白E檢測(cè)試劑盒50mg

(S型)人參皂苷Rh2(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品 Ginsenoside Rh2 猴菌 Hericium erinaceusImproved-Lowry蛋白定量試劑盒

Yohimbine Hydrochloride2-氨基-5-苯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人雙調(diào)蛋白(AREG)Polyclonal Antibody 0.2ml

cTnT(Human cardiac isoform of Tropnin T) ELISA Kit  人心肌特異性肌鈣蛋白TCAS號(hào)：581933 有機(jī)檢測(cè)試盒2mgHuman/人Elisa試盒30608629

99%100g5g小構(gòu)樹醇A554847tissue inhibitors of metalloproteinase 3

10-羥基喜樹堿(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：HPLC>98%,S構(gòu)型，標(biāo)準(zhǔn)品 (s)-10-hydroxycamptothecin

Nicotine氨魯米特標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人血管生長(zhǎng)素(ANG)Polyclonal Antibody 0.2ml

MHC(Human myosin heavy chain) ELISA Kit  人肌球蛋白重鏈CAS號(hào)：552150 羽狀斑駁病檢測(cè)試盒5mgHuman/人Elisa試盒3061367

四基羅丹明5(6)異硫（混合物）5mg

正庚醇(Standard for GC,>99.5%(GC)) 質(zhì)量規(guī)格：Standard for GC,>99.5%(GC) 1-Heptanol

HSA/human Serum albumin  人血清白蛋白進(jìn)口、分裝分泌型天冬氨蛋白酶檢測(cè)試盒25gHuman/人Elisa試盒4869594

棓兒茶; 沒食子酰兒茶素6羧基X羅丹明琥珀酰亞（單一化合物）5mg

 標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基/SPCA用于細(xì)菌總數(shù)的計(jì)數(shù)250克國產(chǎn)/進(jìn)口

Hu Fibrinogen  人纖維蛋白原進(jìn)口、原裝分泌型天冬氨蛋白酶2檢測(cè)試盒25gHuman/人Elisa試盒4870659

芒柄花苷5羧基X羅丹明琥珀酰亞（單一化合物）5mg

三十二(standard for GC,≥98.0%(GC)) 質(zhì)量規(guī)格：standard for GC,≥98.0%(GC) Dotriacontane

Streptavidin,SA  鏈霉親和素現(xiàn)貨供應(yīng)呼腸孤病III型檢測(cè)試盒25gHuman/人Elisa試盒4870659