PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時熒光定量PCR：

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

兔子葡萄糖依賴性胰島素釋放多肽(GIP)ELISA試劑盒Vinculin (E1E9V) XP? Rabbit mAb500 ul

兔子神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)ELISA試劑盒SimpleChIP? Mouse PER1 Intron 1 Primers100 ul

兔子促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒PLD2 (E1Y9G) Rabbit mAb1 Kit

兔血纖蛋白原(Fbg)ELISA試劑盒PathScan? Total BACE Sandwich ELISA Kit100 ul

兔子血纖蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)ELISA試劑盒Phospho-TRAF2 (Ser11) (E2B6L) Rabbit mAb1 Kit

兔子雌二醇(E2)ELISA試劑盒PathScan? Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser240/244) Sandwich ELISA Kit100 ul

兔子E選擇素(E-Selectin/CD62E)ELISA試劑盒 CAMLG (D5L9J) Rabbit mAb100 ul

兔子表皮生長因子(EGF)ELISA試劑盒 eRF1 Antibody100 ul
亞洲分枝桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒25-羥基-原人參二醇78.125-5000pg/mlLGR4(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 4)|GPR48|GPR48G protein-coupled receptor 48|G-protein coupled receptor 48|leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 4

25-羥基-原人參三醇0.156-10ng/mlSRSF2(Serine|arginine-rich splicing factor 2)|Splicing factor|arginine|serine-rich 2|Splicing factor SC35|SC-35|Protein PR264|Splicing component|35 kDa

3,6’－二芥子酰基蔗糖78.125-5000pg/ml3 5 exonuclease TREX1|AGS1|AGS5|CRV|DNase III|DRN3|HERNS|TREX1

3’-甲氧基葛根素0.156-10ng/mlP53CSV| TRIAP1|Protein 15E1.1| WF-1| p53-inducible cell-survival factor| HSPC132

3’-羥基葛根素0.156-10ng/mlSRSF3(Serine|arginine-rich splicing factor 3)|SFRS3|SRP20|Pre-mRNA-splicing factor SRP20|Splicing factor|arginine|serine-rich 3

4-去甲氧基鬼臼毒素0.156-10ng/mlTRIM14

6-羥基-7甲氧基香豆素0.312-20ng/mlDDO|D-aspartate oxidase|DASOX|DDO-1|DDO-2

花椒毒素31.25-2000pg/mlEctodermin homolog|KIAA1113|Protein Rfg7|PTC7|RET fused gene 7 protein|RFG7|TF1G|TIF1 gamma|TIF1G|TIF1GAMMA|TIFGAMMA|TRIM33|tripartite motif containing 33

β,β-二甲基丙烯酰紫草素15.6-1000pg/mlWT1|Wilms tumor protein|GUD|WAGR|WIT-2|WT33|AWT1|NPHS4GUD|WAGR|Wilms tumor 1

β-常山堿78-5000pg/mlHNRNPF|Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F|hnRNP F|Nucleolin-like protein mcs94-1|HNRPF|OK|SW-cl.23|mcs94-1

巴卡亭III0.312-20ng/mlTNFRSF6B|Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B|M68|Decoy receptor 3|DcR3|Decoy receptor for Fas ligand|TR6|TR6DcR3|tumor necrosis factor receptor superfamily|member 6b|decoy

菝葜皂苷元0.312-20ng/mlPDE10A|cAMP and cAMP-inhibited cGMP 3'|5'-cyclic phosphodiesterase 10A

白樺酯酸0.312-20ng/mlMTBP|Mdm2-binding protein|hMTBP|MDM2BP

樺木酸0.312-20ng/mlPPARGC1A|Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha|PGC-1-alpha|PPAR-gamma coactivator 1-alpha|PPARGC-1-alpha|Ligand effect modulator 6|LEM6|PGC1|PGC1A|PPARGC1|PGC-1v|

白蠟樹精0.78-50ng/mlSLC26A4|Pendrin|PDS|Sodium-independent chloride|iodide transporter|Solute carrier family 26 member 4

Cynaroside早期活化抗原CD69檢測試劑盒500mg

千層紙素A-7-0-β-D-葡萄糖苷 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品 Oroxyloside

 wilforlide A氨汀硫醇標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人Atonal蛋白的同源蛋白1(ATOH1)ELISA 試劑盒 0.2ml

人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制子3(TIMP3)BRD1  BRD1蛋白抗體規(guī)格:96T/48TAminobenzoate Potassium規(guī)格:1gCRaf原癌基絲蘇氨蛋白激酶檢測試盒10mg人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞，MHCC97H細(xì)胞1x10^6cells

Luteolin早期前列腺癌抗原2檢測試劑盒20mg

 Schenk&Hildebrandt MediumBR10升國產(chǎn)/進(jìn)口

Luteolin阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人芳基硫酯酶A(ASA)Polyclonal Antibody 0.2ml

人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制子2(TIMP2)BRP44  腦蛋白44抗體規(guī)格:96T/48TAminobenzoate Sodium規(guī)格:1gCREB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄輔激活子1檢測試盒20mg人宮頸癌細(xì)胞，C33A細(xì)胞1x10^6cells

5(6)羧基四基羅丹明（混合物）5mg

 HT-1080(人纖維肉瘤細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

C.L.E.D Medium Supplement1ml*5支四氫孕檢測試盒5mg白細(xì)胞介素10檢測試盒keyholelimpethemocyamin

>98%(GC)25g5MG葡萄糖6脫酶(G6PD)檢測試劑盒(6PGD校正比色法)coagulation factor Ⅸ

己二二甲酯(standard for GC,≥99.5%(GC)) 質(zhì)量規(guī)格：standard for GC,≥99.5%(GC) Dimethyl adipate

GC Agar250卵脂檢測試盒5mg鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白檢測試盒keyholelimpethemocyaminIgGantibody

97%1g1g葡萄糖6脫酶(G6PD)檢測試劑盒(簡易微板法)coagulation factor Ⅷ

 載脂蛋白A1(APOA1)重組蛋白英文名稱：Recombinant Apolipoprotein A1 (APOA1)

BLB Medium250禽流感H5N1檢測試盒5mg鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白IgG抗體檢測試盒Leptin
實(shí)驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實(shí)驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。