定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

兔子前列腺素E1(PGE1)ELISA試劑盒Langerin (D9H7R) XP? Rabbit mAb20 ul

兔子催乳素(PRL)ELISA試劑盒Langerin (D9H7R) XP? Rabbit mAb500 ul

兔子孕激素/孕酮(PROG)ELISA試劑盒SimpleChIP? Human β-Actin Promoter Primers100 ul

兔子Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢNT)ELISA試劑盒Stathmin (D1Y5A) Rabbit mAb100 ul

兔子血小板衍生生長因子(PDGF)ELISA試劑盒IκBα (L35A5) Mouse mAb (Amino-terminal Antigen) (Pacific Blue? Conjugate)100 ul

兔子血小板因子4(PF-4/CXCL4)ELISA試劑盒VCAM-1 (E1E8X) Rabbit mAb100 ul

兔子血小板活化因子(PAF)ELISA試劑盒ZO-1 (D6L1E) Rabbit mAb100 ul

兔子纖溶酶原(Plg)ELISA試劑盒 PI3 Kinase p85α (6G10) Mouse mAb100 ul
牛眼莫拉氏菌探針法熒光定量PCR試劑盒酒石酸長春質(zhì)堿0.312-20ng/mlLRP11|Low-density lipoprotein receptor-related protein 11|LRP-11

桔皮素0.156-10ng/mlCell death protein RIP|Receptor interacting protein 1|RIP|RIP 1|RIP1|RIPK1

開環(huán)異落葉松樹脂酚 7.8-500ng/mlKIAA1377|Uncharacterized protein KIAA1377

開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷1.56-100ng/mlPDIA4|Protein disulfide-isomerase A4|Endoplasmic reticulum resident protein 70|ER protein 70|ERp70|Endoplasmic reticulum resident protein 72|ER protein 72|ERp-72|ERp72

柯諾辛78-5000pg/mlDPP7|DPPII|QPP|carboxytripeptidase|Dipeptidyl aminopeptidase II|dipeptidyl arylamidase II|dipeptidyl peptidase 2|Dipeptidyl peptidase 7|Dipeptidyl peptidase II|dipeptidyl-peptidase 7|DPP2|Quiescent cell proline dipeptidase

苦鬼臼毒素31.2-2000pg/mlTPSG1|Tryptase gamma ?1|gamma I|gamma II|lung tryptase|mast cell protease II|mast cell tryptase|PRSS31skin tryptase|Serine protease 31|Transmembrane tryptase|trpA|tryptase gamma|tryptase gamma 1|tryptase gamma I|tryptase gamma II

奎寧0.312-20ng/mlPDK1|PDPK1|[Pyruvate dehydrogenase [lipoamide]] kinase isozyme 1|mitochondrial|mitochondrial pyruvate dehydrogenase|lipoamide|kinase isoenzyme 1|Pyruvate dehydrogenase kinase isoform 1|pyruvate dehydrogenase kinase|isoenzyme 1|pyruvate dehydrogenase kinase|isozyme 1|PKB kinase

萊鮑迪苷0.78-50ng/mlKPRP|Keratinocyte proline-rich protein|Hkprp

櫟櫻酸   0.312-20ng/mlCYP7A1(Cytochrome P450 7A1)|Cholesterol 7-alpha-monooxygenase|CYPVII|Cholesterol 7-alpha-hydroxylase

連翹脂苷0.156-10ng/mlMYB|Transcriptional activator Myb|Proto-oncogene c-Myb

連翹脂素0.156-10ng/mlKYNU|kynureninase|L-kynurenine hydrolase

氯化木蘭花堿0.312-20ng/mlOAT|Ornithine aminotransferase|mitochondrial|Ornithine delta-aminotransferase|Ornithine--oxo-acid aminotransferase

羅漢果甜苷V0.312-20ng/mlPRG2|Bone marrow proteoglycan|BMPG|Proteoglycan 2

羅漢果甜苷VI0.156-10ng/mlDPP3|Dipeptidyl peptidase 3|Enkephalinase B|Dipeptidyl peptidase III|DPP III|Dipeptidyl aminopeptidase III

羅漢果皂苷IV31.25-2000pg/ml40S ribosomal protein S19|DBA|ribosomal protein S19|RPS19

Tripdiolide粘蛋白2檢測試劑盒20mg

多索茶堿 質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR Doxofylline HCC38(人腺導(dǎo)管細(xì)胞)苜蓿中華根瘤菌 Sinorhizobium meliloti

Stevenleaf阿莫曲坦標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人水通道蛋白5(AQP-5)Polyclonal Antibody 0.2ml

AP13(Human apelin 13) ELISA Kit  人apelin 13CAS號(hào)：138681尼克酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒3047323

Triptolide粘蛋白3檢測試劑盒20mg

20(s)-人參皂苷Rg1; 訂購|咨詢 規(guī)格： 20mg 細(xì)胞纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)同源蛋白20抗體 RHPN2 ELISA Kit Rho蛋白2(RHPN2)ELISA試劑盒

Amygdalin依來曲普坦相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人水通道蛋白1(AQP-1)Polyclonal Antibody 0.2ml

AP36(Human Apelin 36) ELISA Kit  人Apelin 36CAS號(hào)：11680 二酯酶5檢測試盒500gHuman/人Elisa試盒30484776

97%250mg25g性酶同工酶檢測試劑盒(抑制敏感法)Vitamin D Binding protein

防己諾林堿 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品 Fangchinoline GNM(人口腔鱗頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

Rabbit AntiGoat IgM Whole serum  兔抗羊IgM抗血清進(jìn)口、原裝抗雙鏈DNAIgM抗體檢測試盒5gHuman/人Elisa試盒483367108

95%1g500g性酶同工酶檢測試劑盒(熱穩(wěn)定性法)RV IgM

蓖麻油(分析標(biāo)準(zhǔn)品,99%) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品,99% Ricinoleic acid

Rabbit AntiGuinea IgG Whole serum  兔抗豚鼠IgG抗血清現(xiàn)貨供應(yīng)M2型激酶檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒4835909

95%25g100g性酶同工酶檢測試劑盒(熱穩(wěn)定性法)flapendo；exonuclease

 Nitsch培養(yǎng)基(含維生素)/Nitsch Medium with vitaminsBR10升國產(chǎn)/進(jìn)口

Rabbit AntiGuinea IgM Whole serum  兔抗豚鼠IgM抗血清特價(jià)促銷凝血子Ⅷ檢測試盒5gHuman/人Elisa試盒4835909