定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來(lái)也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。

c-Jun氨基末端激酶(JNK)ELISA試劑盒T-bet/TBX21 (D6N8B) XP? Rabbit mAb20 ul

c-jun ELISA試劑盒 T-bet/TBX21 (D6N8B) XP? Rabbit mAb100 ul

檸檬酸合酶(CS)ELISA試劑盒DCP1B (D2P9W) Rabbit mAb100 ul

睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)ELISA試劑盒CD46 (D6N7H) Rabbit mAb100 ul

絨毛膜促性腺激素(CG)ELISA試劑盒Kinectin 1 (D5F7J) Rabbit mAb100 ul

絨毛膜促性腺激素β(β-CG)ELISA試劑盒LIMD1 Antibody100 ul

膽固醇(CH)ELISA試劑盒T7-Tag (D9E1X) XP? Rabbit mAb20 ul

血管緊張素原(aGT)ELISA試劑盒T7-Tag (D9E1X) XP? Rabbit mAb100 ul
曼氏桿菌通用探針?lè)晒舛?/font>PCR試劑盒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒過(guò)敏毒素C5a（補(bǔ)體C5a）抗體62.5-4000pg/mlDEFβ2|DEFB2(Defensin Beta 2)|DEFB4A(Beta-defensin 4A)|DEFB102|DEFB4|SAP1|BD-2|hBD-2|Skin-antimicrobial peptide 1|Beta-defensin 2|Defensin|beta 2|DEFB4B|HBD-2|SAP-1|DEFB-2|DEFB4beta-defensin 4A|Defensin|beta 2Skin-antimicrobial peptide 1|defensin|beta 4|defensin|beta 4A|SAP1BD-2

卵巢癌抗原抗體 0.156-10ng/mlSLC8A1|CNC|NCX1|Sodium|calcium exchanger 1|Solute carrier family 8 member 1

Caspase 激活的脫氧核糖核酸酶抗體15.6-1000pg/mlSLC11A2|DCT1|DMT1|DMT-1|NRAMP2|Solute carrier family 11 member 2|Divalent cation transporter 1|Divalent metal transporter 1

鈣介質(zhì)素抗體0.312-20ng/mlSLC25A12|ARALAR1|Mitochondrial aspartate glutamate carrier 1|Solute carrier family 25 member 12

鈣激活的中性蛋白酶2抗體0.312-20ng/mlSLC25A13|ARALAR2|Citrin|Solute carrier family 25 member 13|Mitochondrial aspartate glutamate carrier 2

磷酸化鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶2α抗體0.312-20ng/ml ZNT8|SLC30A8|ZnT-8|Solute carrier family 30 member 8|zinc transporter 8|zinc transporter ZnT-8

鈣/鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶IG抗體 0.313-20ng/mlUBAP2(Ubiquitin-associated protein 2)

Park7/DJ-1/CAP1抗體15.6-1000pg/mlCDC42(Cell division control protein 42 homolog)|G25K GTP-binding protein

環(huán)化酶相關(guān)蛋白CAP-2抗體0.313-20ng/mlFSCN2(Fascin-2)|Retinal fascin

碳酸酐酶1抗體1.563-100ng/mlREG3γ(Regenerating Islet Derived Protein 3 Gamma)

粘附分子相關(guān)蛋白a1抗體0.156-10ng/mlS1PR2|EDG5(sphingosine 1-phosphate receptor 2)|AGR16|GPCR13|GPCR18|H218|LPB2|EDG-5|S1P2|endothelial differentiation G-protein coupled receptor 5|S1P receptor 2|S1P receptor EDG5|S1P receptor Edg-5|sphingosine 1-phosphate receptor Edg-5

碳酸酐酶2抗體0.156-10ng/mlS1PR3|EDG3|LPB3|S1P3|EDG-3|Endothelial differentiation G-protein coupled receptor 3|S1P receptor 3|S1P receptor EDG3|S1P receptor Edg-3|sphingosine 1-phosphate receptor 3|Sphingosine 1-phosphate receptor Edg-3

半胱胺酸蛋白酶蛋白-12抗體(人)0.125-8ng/mlS1PR4|EDG6|SLP4|Endothelial differentiation G-protein coupled receptor 6|S1P receptor 4|S1P4LPC1|sphingosine 1-phosphate receptor 4|Sphingosine 1-phosphate receptor Edg-6|sphingosine-1-phosphate receptor 4

半胱胺酸蛋白酶蛋白-6抗體（C端）78-5000pg/mlS1PR5|EDG8|LPB4|SPPR-1|SPPR-2|Edg-8|Endothelial differentiation G-protein-coupled receptor 8|S1P receptor 5|sphingosine 1-phosphate receptor 5|sphingosine 1-phosphate receptor Sphingosine 1-phosphate receptor Edg-8

細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白-1抗體15.6-1000pg/mlIL31RA|CRL3|GLM-R|class I cytokine receptor|Cytokine receptor-like 3|GLMR|GP130 like receptor|Gp130-like monocyte receptor|hGLM-R|IL-31 receptor subunit alpha|IL-31R subunit alpha|IL-31R-alpha|interleukin 31 receptor A|soluble type I cytokine receptor CRL3

AstragalosideⅢ中性粒細(xì)胞防御素13檢測(cè)試劑盒20mg

餓螞蝗  英文名稱：Manyflower tickclove herb   保存：-20℃   規(guī)格：1g 色素上皮源性因子抗體

抗核糖體抗體(Anti-rRNP)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 IL17BR / IL17RB / IL-17 Receptor B 蛋白 (His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷1000(g)

Flt3L(Human FMSlike tyrosine kinase 3 ligand) ELISA Kit  人FMS樣酪氨激酶3配體CAS號(hào)：112809515 花青素還原酶檢測(cè)試盒50THuman/人Elisa試盒3034535

AstragalosideⅡ中性粒細(xì)胞防御素3檢測(cè)試劑盒20mg

五味子醇乙;schisandrol B 規(guī)格： 20mg 訂購(gòu)|咨詢 MEM培養(yǎng)基/伊格爾培養(yǎng)基/伊格爾極限必需培養(yǎng)基/MEM/SMEM細(xì)胞培養(yǎng)用10升國(guó)產(chǎn)/進(jìn)口

和肽素(CPP)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 KIT / c-KIT / CD117 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)250(g)

ACE(Human Angiotensin converting enzyme) ELISA Kit  人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶CAS號(hào)：112801 核糖核檢測(cè)試盒100THuman/人Elisa試盒3034535

畢扣扣靈；荷包牡丹；烏龜Lip2000轉(zhuǎn)染試劑5mg

甲基反亞油甲酯(分析標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品 Methyl linolelaidate

pig IgG  (親和純化) 豬IgG進(jìn)口、原裝硫酰肝素檢測(cè)試盒100gHuman/人Elisa試盒478980039

3,5,7三羥基黃CCK試劑盒5mg

3,29-二甲?；闃侨嗜? 英文名稱：3,29- two benzoyl Trichosanthes Jen three alcohol   保存：-20℃   規(guī)格：HPLC≥98% 10mg/支 短鏈L-3羥基輔酶A脫氫酶抗體

pig IgM  (親和純化) 豬IgM現(xiàn)貨供應(yīng)溶血素O檢測(cè)試盒25gHuman/人Elisa試盒478980040

奇壬醇CCK試劑盒5mg

L-亮氨 訂購(gòu)|咨詢 規(guī)格： 20mg 粘蛋白13抗體  

Mink IgG  水貂IgG (親和純化)特價(jià)促銷可溶性凋亡相關(guān)子檢測(cè)試盒100gHuman/人Elisa試盒478980040