

上海邦景實(shí)業(yè)有限公司
主營(yíng)產(chǎn)品: PCR檢測(cè)試劑盒, ELISA試劑盒, 細(xì)胞, 科研抗體, 中藥標(biāo)準(zhǔn)品
邦景曼氏桿菌通用探針?lè)晒舛縋CR試劑盒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒
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上海邦景實(shí)業(yè)有限公司
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上海市閔行區(qū)
主營(yíng)產(chǎn)品
定量PCR方法:
a、競(jìng)爭(zhēng)法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中,待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增(其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記)。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,而待測(cè)模板不被酶切,可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi),分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí),內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái),分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度,以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。
PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途,下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:
方法
1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號(hào) |
曼氏桿菌通用探針?lè)晒舛縋CR試劑盒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒 | Mannheimia spp. | BJP63794 |
熒光定量PCR原理:
產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR,后來(lái)也叫Real-Time PCR,是美國(guó)PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。
一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系,根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期),此時(shí)微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性極好,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,重現(xiàn)性最好的定量方法,已得到全世界的公認(rèn),廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程:
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2.對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無(wú)到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物??梢允荄NA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此,擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4.PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
2.純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗(yàn)一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存,從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
6.產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi),并且要充分混勻。
c-Jun氨基末端激酶(JNK)ELISA試劑盒T-bet/TBX21 (D6N8B) XP? Rabbit mAb20 ul
c-jun ELISA試劑盒 T-bet/TBX21 (D6N8B) XP? Rabbit mAb100 ul
檸檬酸合酶(CS)ELISA試劑盒DCP1B (D2P9W) Rabbit mAb100 ul
睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)ELISA試劑盒CD46 (D6N7H) Rabbit mAb100 ul
絨毛膜促性腺激素(CG)ELISA試劑盒Kinectin 1 (D5F7J) Rabbit mAb100 ul
絨毛膜促性腺激素β(β-CG)ELISA試劑盒LIMD1 Antibody100 ul
膽固醇(CH)ELISA試劑盒T7-Tag (D9E1X) XP? Rabbit mAb20 ul
血管緊張素原(aGT)ELISA試劑盒T7-Tag (D9E1X) XP? Rabbit mAb100 ul
曼氏桿菌通用探針?lè)晒舛?/font>PCR試劑盒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒過(guò)敏毒素C5a(補(bǔ)體C5a)抗體62.5-4000pg/mlDEFβ2|DEFB2(Defensin Beta 2)|DEFB4A(Beta-defensin 4A)|DEFB102|DEFB4|SAP1|BD-2|hBD-2|Skin-antimicrobial peptide 1|Beta-defensin 2|Defensin|beta 2|DEFB4B|HBD-2|SAP-1|DEFB-2|DEFB4beta-defensin 4A|Defensin|beta 2Skin-antimicrobial peptide 1|defensin|beta 4|defensin|beta 4A|SAP1BD-2
卵巢癌抗原抗體 0.156-10ng/mlSLC8A1|CNC|NCX1|Sodium|calcium exchanger 1|Solute carrier family 8 member 1
Caspase 激活的脫氧核糖核酸酶抗體15.6-1000pg/mlSLC11A2|DCT1|DMT1|DMT-1|NRAMP2|Solute carrier family 11 member 2|Divalent cation transporter 1|Divalent metal transporter 1
鈣介質(zhì)素抗體0.312-20ng/mlSLC25A12|ARALAR1|Mitochondrial aspartate glutamate carrier 1|Solute carrier family 25 member 12
鈣激活的中性蛋白酶2抗體0.312-20ng/mlSLC25A13|ARALAR2|Citrin|Solute carrier family 25 member 13|Mitochondrial aspartate glutamate carrier 2
磷酸化鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶2α抗體0.312-20ng/ml ZNT8|SLC30A8|ZnT-8|Solute carrier family 30 member 8|zinc transporter 8|zinc transporter ZnT-8
鈣/鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶IG抗體 0.313-20ng/mlUBAP2(Ubiquitin-associated protein 2)
Park7/DJ-1/CAP1抗體15.6-1000pg/mlCDC42(Cell division control protein 42 homolog)|G25K GTP-binding protein
環(huán)化酶相關(guān)蛋白CAP-2抗體0.313-20ng/mlFSCN2(Fascin-2)|Retinal fascin
碳酸酐酶1抗體1.563-100ng/mlREG3γ(Regenerating Islet Derived Protein 3 Gamma)
粘附分子相關(guān)蛋白a1抗體0.156-10ng/mlS1PR2|EDG5(sphingosine 1-phosphate receptor 2)|AGR16|GPCR13|GPCR18|H218|LPB2|EDG-5|S1P2|endothelial differentiation G-protein coupled receptor 5|S1P receptor 2|S1P receptor EDG5|S1P receptor Edg-5|sphingosine 1-phosphate receptor Edg-5
碳酸酐酶2抗體0.156-10ng/mlS1PR3|EDG3|LPB3|S1P3|EDG-3|Endothelial differentiation G-protein coupled receptor 3|S1P receptor 3|S1P receptor EDG3|S1P receptor Edg-3|sphingosine 1-phosphate receptor 3|Sphingosine 1-phosphate receptor Edg-3
半胱胺酸蛋白酶蛋白-12抗體(人)0.125-8ng/mlS1PR4|EDG6|SLP4|Endothelial differentiation G-protein coupled receptor 6|S1P receptor 4|S1P4LPC1|sphingosine 1-phosphate receptor 4|Sphingosine 1-phosphate receptor Edg-6|sphingosine-1-phosphate receptor 4
半胱胺酸蛋白酶蛋白-6抗體(C端)78-5000pg/mlS1PR5|EDG8|LPB4|SPPR-1|SPPR-2|Edg-8|Endothelial differentiation G-protein-coupled receptor 8|S1P receptor 5|sphingosine 1-phosphate receptor 5|sphingosine 1-phosphate receptor Sphingosine 1-phosphate receptor Edg-8
細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白-1抗體15.6-1000pg/mlIL31RA|CRL3|GLM-R|class I cytokine receptor|Cytokine receptor-like 3|GLMR|GP130 like receptor|Gp130-like monocyte receptor|hGLM-R|IL-31 receptor subunit alpha|IL-31R subunit alpha|IL-31R-alpha|interleukin 31 receptor A|soluble type I cytokine receptor CRL3
AstragalosideⅢ中性粒細(xì)胞防御素13檢測(cè)試劑盒20mg
餓螞蝗 英文名稱:Manyflower tickclove herb 保存:-20℃ 規(guī)格:1g 色素上皮源性因子抗體
抗核糖體抗體(Anti-rRNP)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 IL17BR / IL17RB / IL-17 Receptor B 蛋白 (His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷1000(g)
Flt3L(Human FMSlike tyrosine kinase 3 ligand) ELISA Kit 人FMS樣酪氨激酶3配體CAS號(hào):112809515 花青素還原酶檢測(cè)試盒50THuman/人Elisa試盒3034535
AstragalosideⅡ中性粒細(xì)胞防御素3檢測(cè)試劑盒20mg
五味子醇乙;schisandrol B 規(guī)格: 20mg 訂購(gòu)|咨詢 MEM培養(yǎng)基/伊格爾培養(yǎng)基/伊格爾極限必需培養(yǎng)基/MEM/SMEM細(xì)胞培養(yǎng)用10升國(guó)產(chǎn)/進(jìn)口
和肽素(CPP)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 KIT / c-KIT / CD117 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)250(g)
ACE(Human Angiotensin converting enzyme) ELISA Kit 人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶CAS號(hào):112801 核糖核檢測(cè)試盒100THuman/人Elisa試盒3034535
畢扣扣靈;荷包牡丹;烏龜Lip2000轉(zhuǎn)染試劑5mg
甲基反亞油甲酯(分析標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格:分析標(biāo)準(zhǔn)品 Methyl linolelaidate
pig IgG (親和純化) 豬IgG進(jìn)口、原裝硫酰肝素檢測(cè)試盒100gHuman/人Elisa試盒478980039
3,5,7三羥基黃CCK試劑盒5mg
3,29-二甲?;闃侨嗜? 英文名稱:3,29- two benzoyl Trichosanthes Jen three alcohol 保存:-20℃ 規(guī)格:HPLC≥98% 10mg/支 短鏈L-3羥基輔酶A脫氫酶抗體
pig IgM (親和純化) 豬IgM現(xiàn)貨供應(yīng)溶血素O檢測(cè)試盒25gHuman/人Elisa試盒478980040
奇壬醇CCK試劑盒5mg
L-亮氨 訂購(gòu)|咨詢 規(guī)格: 20mg 粘蛋白13抗體
Mink IgG 水貂IgG (親和純化)特價(jià)促銷可溶性凋亡相關(guān)子檢測(cè)試盒100gHuman/人Elisa試盒478980040