定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

白血病抑制因子(LIF)ELISA試劑盒TAL1 Antibody100 ul

白血病抑制因子受體(LIFR)ELISA試劑盒TPX2 (D9Y1V) Rabbit mAb100 ul

鉤端螺旋體IgG(Lep IgG)ELISA試劑盒 AHSA1 Antibody100 ul

瘦素(LEP)ELISA試劑盒β-Amyloid (1-42 Specific) (D3E10) Rabbit mAb100 ul

可溶性瘦素受體(sLR)ELISA試劑盒DNAJC2/MPP11 (D6B1E) Rabbit mAb300 ul

苗條素受體(LR/Ob-R)ELISA試劑盒SignalSilence? Puma siRNA I100 ul

低密度脂蛋白免疫復(fù)合物(LDL-IC)ELISA試劑盒PAX9 (D9F1N) Rabbit mAb300 units

層連蛋白/板層素(LN)ELISA試劑盒DyLight? 350 Phalloidin100 ul
杜氏利什曼蟲(黑熱病病原蟲)探針法熒光定量PCR試劑盒鼠抗人白細(xì)胞介素-2抗體0.313-20ng/mlActin, alpha skeletal muscle|Alpha-actin-1|Actin, alpha skeletal muscle, intermediate form|ACTA1|ACTA

白介素-23抗體15.6-1000pg/mlIL-25|IL-17E

白介素4抗體3.906-250pg/mlIL-1α|IL-1alpha|IL1A|IL1-A|IL1|IL1F1|Preinterleukin 1 Alpha|Hematopoietin-1|Pro-Interleukin-1-Alpha

白介素63.9-250pg/mlIL-1β|IL-1beta|IL1B|IL1-BETA|IL1F2|catabolin

白介素6抗體0.156-10ng/mlIL1R1(Interleukin 1 Receptor Type I)||IL-1R1

白介素8抗體0.313-20ng/mlIL1R2|IL-1R2|CD121b|CDw121b|IL-1R-2|IL-1RT-2|IL-1RT2|IL1R2c|IL1RB

整合素連接激酶-1抗體78-5000pg/mlIL1RL1(Interleukin-1 receptor-like 1)|IL-1RL1|Protein ST2|DER4|ST2|T1

生長抑制因子基因1抗體15.6-1000pg/mlIL-2(Interleukin 2)|IL2|TCGF|Lymphokine

抑制素α抗體62.5-4000pg/mlIL-20|IL20|ZCYTO10|IL10D

胰島素受體-α抗體15.625-1000pg/mlIL-22|IL22|IL-D110|IL-TIF|ILTIF|TIFIL-23|TIFa|zcyto18

胰島素1-51蛋白抗體15.625-1000pg/mlIL-24(Interleukin 24)

整合素α3β1抗體0.156-10ng/mlIL-27(IL-27 subunit alpha)|IL-27-A|IL27-A

整合素α4β7抗體31.2-2000pg/mlIL-28A|Cytokine Zcyto20|Interferon lambda-2(IFN-lambda-2)

整合素avb3抗體15.625-1000pg/mlIL-29

整合素αE2抗體15.625-1000pg/mlIL-3|IL3|MCGF|MCSF|MULTI-CSF|P-Cell Stimulating Factor

97%1g5g對葉百部2433967Catalase

16-DOXYL-硬脂自由基(>95.0%(HPLC)(T)) 質(zhì)量規(guī)格：>95.0%(HPLC)(T) 16-DOXYL-stearic Acid Free Radical 光帽鱗傘 Pholiota nameko釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

踝蛋白(TLN)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)重組人 IDI2 蛋白 (His 標(biāo)簽)特價供應(yīng)250(g)

人基質(zhì)金屬蛋白酶5(MMP5)KLHDC8A  KLHDC8A蛋白抗體規(guī)格:96T/48T規(guī)格:200mg70kDa熱休克蛋白5檢測試盒10mg恒河猴細(xì)胞，MA104細(xì)胞1x10^6cells

98%500g25g次二丹參醌7138401hydrogen peroxide

蒲公英甾醇 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢 ELISA Kit for Human Claudin-3小鼠環(huán)孢素A(CsA)ELISA試劑盒，英文名：CsA ELISA Kit

鈣聯(lián)蛋白(CNX)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)重組人 PPT1 / Palmitoyl-protein thioesterase 1 蛋白 (His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷250(g)

人基質(zhì)金屬蛋白酶4(MMP4)KLHDC9  KLHDC9蛋白抗體規(guī)格:96T/48T規(guī)格:100mg8羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶檢測試盒20mg猴胚胎上皮細(xì)胞，marc145細(xì)胞1x10^6cells

川皮亭;蜜橘黃素纖維蛋白原(BFI)測定試劑盒<1200tests>5mg

二甲硝咪唑(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品 Dimetridazole

Rabbit AntiGuinea IgM  兔抗豚鼠IgM        （親和層析純化）現(xiàn)貨供應(yīng)酪氨激酶2檢測試盒500gHuman/人Elisa試盒475102137

纖維蛋白原(BFI)測定試劑盒<含IBS>5mg

楊芽黃素;Tectochrysin 規(guī)格： 20mg 訂購|咨詢 GES-1全細(xì)胞裂解液100ug100ug

Rabbit Antihorse IgG  兔抗馬IgG          （親和層析純化）特價促銷信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活子3檢測試盒100gHuman/人Elisa試盒475207591

豆腐果甙；豆腐果素纖維蛋白原(BFI)測定試劑盒<含IBS>5mg

乙鈀 質(zhì)量規(guī)格：BC Palladium (II) acetate 熱帶假絲酵母 Candida tropicalis嗜桿菌 Lactobacillus acidophilus

Gelatin Medium Base250抗父體淋細(xì)胞性抗體檢測試盒5mg胰島素樣生長子1檢測試盒VitaminD3