熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

肝脂酶(HL)ELISA試劑盒Catalase (D4P7B) XP? Rabbit mAb100 ul

血紅素氧合酶2(HO-2)ELISA試劑盒Mannose Receptor Antibody100 ul

血紅素氧合酶1(HO-1)ELISA試劑盒PSMD10/Gankyrin Antibody100 ug

幽門螺旋菌IgG(Hp-IgG)ELISA試劑盒Epothilone B100 ul

熱休克蛋白47(HSP47)ELISA試劑盒MSH6 (3E1) Mouse mAb100 ul

熱休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)ELISA試劑盒β-Amyloid (1-40 Specific) (D8Q7I) Rabbit mAb100 ul

熱休克蛋白90(HSP-90)ELISA試劑盒UBE2T (D2L7H) Rabbit mAb100 ul

熱休克蛋白70(HSP-70)ELISA試劑盒Spry1 (D9V6I) Rabbit mAb100 ul
住白細(xì)胞原蟲屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒谷氨酸受體1抗體0.313-20ng/mlTF(Transferrin)|PRO1557|PRO2086|TFQTL1|Siderophilin|Beta-1 metal-binding globulin|Beta-1 metal-binding globulin|serotransferrin|Serotransferrin

谷氨酸受體2A抗體31.25-2000ng/mlsTfR1(Soluble Transferrin Receptor1)

谷氨酸受體2B抗體31.25-2000pg/mlC-P|C-Peptide|Connecting Peptide

谷氨酸受體2C抗體31.2-2000pg/mlPI(Proinsulin)

谷氨酸受體2D抗體7.813-500mIU/mlhCG-H(Hyperglycosylated Chorionic Gonadotropin)

原癌基因抗體1.563-100mIU/mlFSH(Follicle-Stimulating Hormone)

核因子2相關(guān)因子2抗體0.313-20ng/mlLTF|LF(Lactoferrin)

神經(jīng)纖毛蛋白-1抗體0.938-60mIU/mlLH(Luteinizing Hormone)|Lutropin|Lutrophin

神經(jīng)纖毛蛋白-2抗體0.313-20uIU/mlTSH|Thyroid Stimulating Hormone

核小體結(jié)合蛋白1抗體1.563-100ng/mlIGFBP-5|IBP5|IBP-5|IGF-binding protein 5|insulin-like growth factor binding protein 5|IGFBP5

神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體0.156-10ng/mlMUC-1|CD227|Episialin|H23AG|KL-6|Mucin-1|PEM|PEMT|Breast carcinoma-associated antigen DF3|Carcinoma-associated mucin|CD227|CD227 antigen|DF3 antigen|EMA|episialin|H23 antigen|H23AG|KL-6|MAM6|MUC1|ZD|mucin 1|cell surface associated|mucin 1|transmembrane|mucin-1|Peanut-reactive urinary mucin|PEMMUC-1|SEC|PEMT|Polymorphic epithelial mucin|PUMMUC-1|X|tumor associated epithelial mucin|Tumor-associated epithelial membrane antigen|Tumor-associated mucin

神經(jīng)營養(yǎng)因子-3抗體93.75-6000pg/mlCAM(Calmodulin)|Calcium-modulated protein

神經(jīng)生長因子4/5抗體31.2-2000pg/mlRAGE|AGER

神經(jīng)生長因子抗體0.313-20ng/mlGFAP|FLJ45472|glial fibrillary acidic protein

核受體相關(guān)因子-1抗體0.156-10ng/mlMBL2|MBL|MBP|MBP1|MBPD|MBL2D|MBP-C|COLEC1|HSMBPC|L-MBP|MBL-C|L-MBP|mannose-binding protein C|mannose-binding lectin(protein C) 2

98%500g5g(E)3'羥基4'基肉桂27828fibronectin typeⅢ domaincontaining protein 5

三(2-乙基)酯(>97.0%(GC)) 質(zhì)量規(guī)格：>97.0%(GC) Tris(2-chloroethyl) Phosphate Calu-6(人肺退行性細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

載脂蛋白H(APOH)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)重組人 PGD2 / PGDS / HPGDS 蛋白 (His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷250(g)

人免疫球蛋白G(IgG)ELISA試盒Ube2H/UBCH2  泛素激活酶2H抗體規(guī)格:96T/48TAcetylcholine Chloride規(guī)格:15mgⅡ型膠原C端肽檢測試盒10mg人膀胱癌細(xì)胞，HT1376細(xì)胞1x10^6cells

Tanshinone IIAsulfonic sodium腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子1檢測試劑盒20mg

大豆皂苷Ba 訂購|咨詢 規(guī)格： 10mg 人α-甲基?；o酶a消旋酶（AMACR）ELISA試劑盒人96T1.56-100 ng/mL小鼠神經(jīng)絲蛋白(NF)ELISA試劑盒，英文名：NF ELISA Kit

干擾素β(IFNβ)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)重組人 RBP5 / Retinol binding protein 5 蛋白 (His 標(biāo)簽)特價供應(yīng)250(g)

人免疫球蛋白M(IgM)ELISA試盒Ube2G1/UBC7  泛素蛋白連接酶G1抗體規(guī)格:96T/48TAcetylcysteine規(guī)格:300mgⅡ型膠原抗體檢測試盒10mg人膀胱癌細(xì)胞，RT112細(xì)胞1x10^6cells

97%500g25ml直接膽紅素(DBIL)檢測試劑盒(改良JendrassikGrof比色法)Epidermal growth factor receptor 2 antibody

腸道病毒71型IgM抗體國家參考品 規(guī)格： 27支/套 訂購|咨詢 HT-29全細(xì)胞裂解液100ug100ug

Peptone from Casein Agar250腺病IgM抗體檢測試盒5mg熱休克蛋白27檢測試盒shortchainfattyacids

SUPER Green II （效果同SYBR Green II）RNA染料（10,000× DMSO溶液）（電泳級）5mg

11－基乳香;beta-boswel 訂購|咨詢 規(guī)格： 5mg 跨膜蛋白TMEM176B抗體 BAG3 ELISA Kit Bcl2關(guān)聯(lián)永生基因3(BAG3)ELISA試劑盒

Dextrose Peptone Medium250谷胱甘肽過氧化物酶3檢測試盒5mg短鏈脂肪檢測試盒Mycoplasmamycoidesantibody

石蒜鹽鹽SUPER Green I （效果同SYBR Green I）核染料（20× DMSO溶液）（PCR級）5mg

角鯊 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢 ELISA Kit for Human Sperm protamine P1大鼠白介素1β前體(pro-IL1B)ELISA試劑盒，英文名：pro-IL1B ELISA Kit

Antibiotic Agar No.4250低氧誘導(dǎo)子2檢測試盒5mg絲狀支原體抗體檢測試盒Bonemorphogeneticprotein4