上海邦景實(shí)業(yè)有限公司
主營產(chǎn)品: PCR檢測試劑盒, ELISA試劑盒, 細(xì)胞, 科研抗體, 中藥標(biāo)準(zhǔn)品
邦景回歸熱疏螺旋體探針法熒光定量PCR試劑盒廠家
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主營產(chǎn)品
PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途,下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:
方法
1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號 |
回歸熱疏螺旋體探針法熒光定量PCR試劑盒 | Borrelia recurrentis | BJP63345 |
熒光定量PCR原理:
產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號,這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。
一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對數(shù)期),此時(shí)微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性極好,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,重現(xiàn)性最好的定量方法,已得到全世界的公認(rèn),廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
定量PCR方法:
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增(其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記)。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí),內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強(qiáng)度,以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。
氯鉻酸吡啶鎓 26299-14-9磷酸苯哌林溶菌酶(LZM)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%
2-溴-2',4'-二氯苯乙酮 2631-72-3米諾地爾煙堿型膽堿受體α4(CHRNα4)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)>98.0%(GC)
2-溴-2',4'-二氯苯乙酮 2631-72-3尼爾雌甲酰肽受體2(FPR2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)>98.0%(GC)
2-溴-3',4'-二氯苯乙酮 2632-10-2
■鹽酸 布魯東氏酪氨酸激酶(Btk)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)>98.0%(GC)
4-甲氧基-α-溴代苯乙酮 2632-13-5羥甲磷脂酰絲氨酸受體(PSR)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%
4-甲氧基-α-溴代苯乙酮 2632-13-5十一酸睪酮免疫缺陷伴血小板減少綜合征蛋白(WASP)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%
4-甲氧基-α-溴代苯乙酮 2632-13-5石杉堿甲成纖維細(xì)胞生長因子7(FGF7)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%
1,2-苯并異噻唑啉-3-酮(BIT) 2634-33-5雙嘧達(dá)莫環(huán)加氧酶2(PTGS2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%
1,2-苯并異噻唑啉-3-酮(BIT) 2634-33-5色甘酸鈉轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%
1,2-苯并異噻唑啉-3-酮(BIT) 2634-33-5羧甲司坦膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%
L-絲氨酸乙酯鹽酸鹽 26348-61-8魚腥草素鈉前列腺素D2(PGD2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)99%
L-絲氨酸乙酯鹽酸鹽 26348-61-8維生素B12酮酸脫氫酶β(PDHβ)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)99%
1-溴-3,4-(亞甲基二氧基)苯 2635-13-4消旋山莨菪堿煙堿型膽堿受體α2(CHRNα2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)97%
1-溴-3,4-(亞甲基二氧基)苯 2635-13-4月桂氮卓酮脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(apoTf)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)97%
1-溴-3,4-(亞甲基二氧基)苯 2635-13-4亞葉酸鈣延胡索酸酶(FUM)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)97%
回歸熱疏螺旋體探針法熒光定量PCR試劑盒氟化鈉CEACAM16/CEAL2 癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子16抗體 100 ul
苛性鈉CEACAM19/CEAL1 癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子19抗體 100 ul
乙二酸鈉ADCK5 ADCK5蛋白抗體 20 ul
一硫化鈉ITGB1BP2/CHORDC3 整合素β1結(jié)合蛋白2抗體 100 ul
偏鋁酸鈉CLDND2 膜蛋白CLDND2抗體 100 ul
偏銻酸鈉CLLD7 鳥嘌呤核苷酸交換因子CLLD7抗體 100 ul
二水鉍酸鈉CLN3 神經(jīng)細(xì)胞蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病蛋白CLN3抗體 100 ul
冰堿CLN6 神經(jīng)細(xì)胞蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病蛋白CLN6抗體 100 ul
鉻酸二鈉CLPTM1 唇裂和腭裂相關(guān)跨膜蛋白1抗體 100 ul
四水鉻酸二鈉CMT/Icmt 異戊烯半胱氨酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶抗體 100 ul
冰晶石CKLFH1/CMTM1 趨化素樣因子超家族成員1抗體 100 ul
四氟鈉β-Amyloid 1-42(CT) β淀粉樣肽1-42 (C端)抗體 20 ul
偏磷酸六鈉CKLFH3/CMTM3 趨化素樣因子超家族成員3抗體 100 ul
多聚偏磷酸鈉CKLFH4/CMTM4 趨化素樣因子超家族成員4抗體 300 ul
酸鈉CKLFH5/CMTM5 趨化素樣因子超家族成員5抗體 100 ul
實(shí)驗(yàn)過程:
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2.對應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物??梢允荄NA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此,擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
2.純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗(yàn)一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
6.產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開,并且要充分混勻。