熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來(lái)也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。

甲基烯酸芐基酯 2495-37-6221 野燕枯 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：0.25g基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%,含50-100ppmMEHQ穩(wěn)定劑

甲基烯酸芐基酯 2495-37-6223 除蟲脲 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：0.25g基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP10)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%,含50-100ppmMEHQ穩(wěn)定劑

烯基磺酸 2495-39-8225 二氟吡隆  標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：10ml基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP10)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)90%

烯基磺酸 2495-39-8230 脫葉賽,噻節(jié)因  標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：10mg基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)90%

烯基磺酸 2495-39-8248 代森錳 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：0.25g基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)90%

4,4'-雙[二(3,5-二甲苯基)氨基]-4''-苯基三苯胺 249609-49-2248 代森錳鋅 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：0.25g巨噬細(xì)胞炎性蛋白3β(MIP3β)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%

原丁酸三乙酯 24964-76-9248 代森鋅 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：0.25g胱天蛋白酶11(CASP11)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)90%

聚氧乙烯二胺 24991-53-5250 敵草隆  標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：0.25g胱天蛋白酶11(CASP11)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)M.W 4000

聚乙二二甲 (NHD) 24991-55-7272 乙氧喹啉（乙氧基喹啉） 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：0.1g巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β(MIP1β)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)average Mn ~250

聚乙二二甲 (NHD) 24991-55-7283 氨磺磷 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：0.1g巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α(MIP1α)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)average Mn ~250

頻那 25015-63-8288 苯丁錫,六苯丁錫氧 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)： 0.25g巨噬細(xì)胞來(lái)源趨化因子(MDC)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)97%

5-溴-2-甲氧基苯甲 25016-01-7299 唑螨酯 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：0.1g巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%

5-溴-2-甲氧基苯甲 25016-01-73 1-萘乙酸  標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：0.5g單核細(xì)胞趨化蛋白3(MCP3)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%

N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二基)-L-組氨酸 25024-53-7301 三苯基氯化錫  標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：0.25g單核細(xì)胞趨化蛋白3(MCP3)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%

1,3-二(2,6-二異基苯基)氯化咪唑 250285-32-6301 三苯基氫氧化錫  標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：0.25g單核細(xì)胞趨化蛋白2(MCP2)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)97%
長(zhǎng)雙歧桿菌探針?lè)晒舛?/font>PCR試劑盒EDTA鐵鈉REC8  減數(shù)分裂重組蛋白家族REC8抗體 100 ul

EDTA二鈉鎂四水物SA1/Nuclear protein stromal antigen 1  粘結(jié)蛋白SA1抗體 100 ul

EDTA二鈉鎂SA2  粘結(jié)蛋白SA2抗體 100 ul

四乙酸二氨基乙烯二鈉鹽phospho-REC8(Ser251)  磷酸化減數(shù)分裂重組蛋白家族REC8抗體 100 ul

乙二胺四乙酸鈣二鈉SMC2  染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白2抗體 100 ul

乙二胺四乙酸錳二鈉SMC4  染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4抗體 100 ul

乙二胺四乙酸鋅二鈉SMC5  染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白5抗體 100 ul

乙二胺四乙酸銅二鈉SMC6  染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白6抗體 100 ul

EDTA四鈉鹽TRIP1/PSMC5  甲狀腺受體相互作用蛋白1抗體 100 ul

乙二胺四乙酸Separase  紡錘體級(jí)以外蛋白樣1抗體 100 ul

EDTA三鹽二水合物WAPL  EBV核蛋白2抗體 20 ul

脂磷壁酸CAPD3/hCAP-D3  濃縮素2復(fù)合亞基D3抗體 100 ul

軟脂酸AMSH  信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)銜接結(jié)合蛋白抗體 100 ul

枸櫞酸ASB3  錨蛋白重復(fù)序列-細(xì)胞因子信號(hào)抑制物盒蛋白家族3抗體 100μl

2-羥基羧酸EIF2C1/Ago1  真核翻譯起始因子2C1抗體 100 ul