PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

2-溴-5-甲氧基苯甲酸 22921-68-2氯菊酯 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：52315-07-8 100mg激肽釋放酶3(KLK3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)>98.0%(GC)

2-溴-5-甲氧基苯甲酸 22921-68-2環(huán)唑 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：113096-99-4 100MG糖抗原125(CA125)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)>98.0%(GC)

1-乙基氯化吡啶鎓 2294-38-4嘧菌環(huán)胺 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：121552-61-2 250MG糖抗原15-3(CA15-3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%

1-乙基氯化吡啶鎓 2294-38-4滅蠅胺 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：66215-27-8 250MG糖抗原19-9(CA19-9)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%

3-氨基苯硫酚 22948-02-3達(dá)氟沙星 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：112398-08-0 100MG糖抗原242(CA242)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)97%

3-氨基苯硫酚 22948-02-3滴滴涕(4.4-DDT) 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：50-29-3 100MG激活素AB(ACVAB)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)97%

5-氯-2-甲氧基苯磺酰氯 22952-32-5滴滴涕及其代謝物 套裝 1ml鱗狀細(xì)胞癌抗原2(SCCA2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%

5-氯-2-甲氧基苯磺酰氯 22952-32-5溴菊酯,四溴菊酯 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：52918-63-5 250MGα2-纖溶酶抑制因子(α2PI)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)98%

2,4-噻唑烷二酮 2295-31-0溴菊酯,四溴菊酯標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)： 52918-63-5 100MG組織多肽抗原(TPA)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)99%

2,4-噻唑烷二酮 2295-31-0甲基內(nèi)吸磷 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：919-86-8 50MG泛素(Ub)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)99%

2,4-噻唑烷二酮 2295-31-0甜菜安 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：13684-56-5 250MG胃蛋白酶原A(PGA)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)99%

4-異喹啉甲 22960-16-3地塞米松 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：.50-2-2 250MG胃蛋白酶原C(PGC)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)97%

4-異喹啉甲 22960-16-3丁嘧脲 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：80060-09-9 250MG前列腺素E合酶(PTGES)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)97%

4-異喹啉甲 22960-16-3燕麥敵 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：2303-16-4 100MG前列腺酸性磷酸酶(ACP3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)97%

GW9662 22978-25-2敵菌凈 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號(hào)：5355-16-8 100MG熱休克轉(zhuǎn)錄因子4(HSF4)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)≥98%
邦景吉氏巴貝斯蟲探針法熒光定量PCR試劑盒價(jià)格玫瑰紅Casein Kappa/CSN3/COPS3  K-酪蛋白抗體 100 ul

四氯四熒光素二鈉CXXC5  二硫鍵氧化還原酶鋅指蛋白5抗體 100 ul

天狼星玫紅BBDMTF1  周期素D相互作用蛋白1抗體 500 ul

伊紅BGMCL1L  生殖細(xì)胞樣蛋白1樣蛋白抗體 100 ul

伊紅Y(水溶) KLLN   Killin-p53調(diào)節(jié)復(fù)制抑制蛋白抗體 100 ul

伊紅Y(溶)HFREP1/FGL1  肝細(xì)胞源性纖維蛋白原相關(guān)蛋白1抗體 100 ul

1-［2,5-二甲基-4-(2,5-二偶氮)苯偶氮］-2萘酚Fibrinogen gamma chain  人纖維蛋白原γ鏈抗體 100 ul

猩紅SFibrinopeptide B  纖維蛋白肽B抗體（血纖肽B） 100 ul

次甲基蘭Mitochondrial ribosomal protein L11  線粒體核糖體蛋白L11抗體 100 ul

四溴酚藍(lán)STK40  絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶40抗體 100 ul

伊文斯蘭BOD1  雙向染色體細(xì)胞分裂蛋白1抗體 100 ul

硝基四唑紫phospho-ANAPC1(Ser377)  磷酸化細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合蛋白APC1抗體 100 ul

氮藍(lán)四唑Agrin  聚集蛋白抗體 100 ul

還原靛藍(lán)CENPT  著絲粒蛋白T抗體 20 ul

5,5′-靛藍(lán)二磺酸二鈉鹽RanGAP1  RAN GTPase酶激活蛋白1抗體 100 ul
實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。