PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

(S, S)-環(huán)己二胺 21436-03-3L-4-羥基異亮氨酸干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF4)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

(S, S)-環(huán)己二胺 21436-03-3亞麻木酚素表皮轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGM3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

(S, S)-環(huán)己二胺 21436-03-3α-倒捻子素肌動蛋白束蛋白(FSCN)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

(S, S)-環(huán)己二胺 21436-03-3β-倒捻子素核糖核酸酶A3(RNASE3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

2-苯甲酸頻哪酯 214360-48-23-異倒捻子素羥甲基戊二酰輔酶A合酶(HMGCS)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

2-苯甲酸頻哪酯 214360-48-2菊苣酸胰腺再生蛋白Iα(REG1α)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

2-溴吡啶-5-酸頻哪酯 214360-62-0梭砂貝母堿抑瘤素M受體(OSMR)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)97%

2-溴吡啶-5-酸頻哪酯 214360-62-0地膚子皂苷Ic抑制素βB(INHβB)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)97%

4-氨基苯酸頻哪酯 214360-73-3大薊苷細(xì)胞色素b-561(CYB561)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

4-氨基苯酸頻哪酯 214360-73-32”-O-沒食子?；鸾z桃苷主要穹窿蛋白(MVP)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

2-氨基-6-氯苯甲酸 2148-56-39-甲氧基喜樹堿鈣腔蛋白(CALU)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

2-氨基-6-氯苯甲酸 2148-56-3鹽酸石蒜堿淀粉酶α(Amyα)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

,6-二氟-4-羥基苯甲酸 214917-68-7光甘草定白介素2受體α(IL2Rα)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)>98.0%(GC)

,6-二氟-4-羥基苯甲酸 214917-68-7橙黃決明素毒蕈堿型膽堿受體M3(CHRM3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)>98.0%(GC)

3,5-二甲氧基苯甲酸甲酯 2150-37-0荷葉堿小表皮粘蛋白(SBEM)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)99%
邦景溶血隱秘桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒說明書吲哚丁酸ABH8/ALKBH8  AlkB同源蛋白8抗體 20 ul

吲哚丁酸AMFR/Gp78/RNF45  環(huán)指蛋白45/自分泌運動因子受體抗體 100 ul

1-萘乙酸AMBP/Alpha 1 microglobulin  α1微球蛋白抗體 100 ul

1-萘乙酸A2BP1/Fox1  共濟失調(diào)蛋白2結(jié)合蛋白1抗體 100 ul

2-萘乙酸RLLM1/C14orf166  胰腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白RLLM1抗體 100 ul

1-三十烷ABC2/C17orf71  乳腺癌增強蛋白2抗體 100 ul

青鮮素CA8  碳酸酐酶相關(guān)蛋白8抗體 100 ul

青鮮素鹽CACNB1  鈣通道電壓依賴性β1蛋白抗體 100 ul

二苯氨基脲CDK5RAP3  周期素依賴性激酶5激活結(jié)合蛋白C53抗體 100 ul

鹽酸甜菜堿CENPH  著絲粒蛋白H抗體 100 ul

甜菜素CKAP4  細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白4抗體 100 ul

秋水仙素CRISP3  富含半胱氨酸分泌蛋白3抗體 20 ul

脫碳秋水仙堿CKMT/Creatine kinase MT  酸性型線粒體肌酸激酶抗體 100 ul

消炎痛SCRO/DCUN1D1  鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)蛋白抗體 100 ul

腺嘌呤核苷DDX53/CT26  腫瘤/睪丸抗原26抗體 100 ul
實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。