細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；優(yōu)質胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配，液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數換液方式，棄去半數培養(yǎng)基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。懸浮細胞凍存時，應將細胞收集，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，少量保存上清液（防止細胞吸走），加入部分新鮮培養(yǎng)基，吹打均勻后，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO搖勻后進行凍存。

運輸和保存：

視天氣狀況和運輸距離遠近，公司與客戶協(xié)商后選擇下述方式中的一種進行。

1)1mL凍存細胞懸液裝于1.8ml的凍存管中，置于裝滿干冰的泡沫保溫盒中進行運輸；收到細胞后請盡快解凍復蘇細胞進行培養(yǎng)，如無法立刻進行復蘇操作，凍存細胞可在-80℃的條件下保存1個月。

2)T-25培養(yǎng)瓶充滿完全培養(yǎng)基后進行常溫運輸；收到細胞后請鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，如鋪瓶率超過85%請立即進行傳代操作，如懸浮的細胞較多，請將培養(yǎng)瓶至于培養(yǎng)箱中靜置過夜以幫助未死亡的懸浮細胞能夠再次貼壁。
實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

    1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，*將組織剪成1mm3左右大??；

    2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

    3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織完全被消化；

    4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

    5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

    1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

    2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

    3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

    4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗（Abbioscience公司），然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

    5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

    6、用PBS沖洗3次，每次10min，*在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

以下是公司正在打折促銷產品：

CCA(HumanColonCancerAntigen)ELISAKit人結腸癌抗原  規(guī)格：20mg  訂購|咨詢

p53(Mousep53/tumorprotein)ELISAKit小鼠p53  規(guī)格：10mg  訂購|咨詢

cGMP(MouseCyclicguanosinemonophosphate)ELISAKit小鼠環(huán)磷酸鳥苷  規(guī)格：20mg  訂購|咨詢

HumanH-rasELISAKit人H-ras  規(guī)格：20mg  訂購|咨詢

Hpt/HPELISAKit大鼠結合珠蛋白/觸珠蛋白  規(guī)格：20mg  訂購|咨詢

Alpha1-AGPELISAKit大鼠α1酸性糖蛋白  規(guī)格：20mg  訂購|咨詢

NOS(Mousenitricoxidesynthase)ELISAKit小鼠合成酶  規(guī)格：20mg  訂購|咨詢

Humanc-sisELISAKit人c-sis  規(guī)格：20mg  訂購|咨詢

iNOS(Mouseinduciblenitricoxidesynthase)ELISAKit小鼠誘導型合成酶  規(guī)格：20mg  訂購|咨詢

eNOS-3ELISAKit大鼠內皮型合成酶3  規(guī)格：20mg  訂購|咨詢

Humanc-junELISAKit人c-jun  規(guī)格：20mg  訂購|咨詢

Humanc-fosELISAKit人c-fos  規(guī)格：20mg  訂購|咨詢

eNOS(MouseEndothelialnitricoxidesynthase)ELISAKit小鼠內皮型合成酶  規(guī)格：0.1g  訂購|咨詢

CETPELISAKit大鼠膽固醇酯轉移蛋白  規(guī)格：0.1g  訂購|咨詢

aGTELISAKit大鼠血管緊張素原  規(guī)格：0.1g  訂購|咨詢
BEL/FU人肝癌耐氟尿嘧啶細胞株Bakuchiol丹參酮IIA-磺酸鈉(標準品)  分子式：C30H42O8  性狀：Powder  純度：97.0%

Pinostilbenoside丹酚酸A（標準品）  分子式：C30H44O8  性狀：Powder  純度：98.0%

3,5-Diprenyl-4-hydroxybenzaldehyde丹酚酸B（標準品）  分子式：C28H42O7  性狀：Powder  純度：%

Methyl 3-hydroxy-4,5-dimethoxybenzoate丹酚酸C（標準品）  分子式：C49H80O17  性狀：Powder  純度：93.0%

5''-O-Syringoylkelampayoside A丹酚酸D(標準品)  分子式：C49H78O17  性狀：Powder  純度：97.5%

Antiarol膽固醇(標準品)  分子式：C27H44O3  性狀：Powder  純度：98.0%

4-(trans)-Acetyl-3,6,8-trihydroxy-3-methyldihydronaphthalenone膽固醇  分子式：C42H64O17  性狀：Powder  純度：95.0%

Confluentic acid膽酸  分子式：C42H64O14  性狀：Powder  純度：%

Isomartynoside膽酸(標準品)  分子式：C42H62O17  性狀：Powder  純度：96.0%