熒光定量PCR服務(wù)：

簡介：實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。

1、熒光定量PCR服務(wù)要求：

（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。

（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。

（03）請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來源等

2、熒光定量PCR操作程序

（01）引物（探針）設(shè)計與合成。

（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結(jié)果分析。

（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料。

3、熒光定量PCR的收費標準：

  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進行不同的收費標準。

通用原則：

1， 先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近于探針。

2， 擴增子的長度應(yīng)不超過400bp，理想的*能在100－150bp內(nèi)，擴增片斷約短，有效的擴增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴增片斷也容易保證分析的一致性

3， 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會導(dǎo)致擴增效率的降低，及在SG分析中非特異信號。

4， 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G）

5， 將引物和探針互相進行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。

b），探針設(shè)計指導(dǎo)

1，在設(shè)計引物之前設(shè)計探針

2，探針的Tm值應(yīng)在68－70℃之間，如果是目測探針，則要仔細審查GC富含區(qū)。

3，探針的5’端要避免有鳥氨酸，5’G會有淬滅作用，即使被切割下來這種淬滅作用也還會存在

4，選擇C多于G的鏈作探針，G的含量多于C會降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針。

6， 探針應(yīng)盡可能的短，不要超過30個bp。

7， 檢測探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)。

產(chǎn)品及特點:

口腔鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒是從土壤農(nóng)桿菌 CP4 菌株中分離得到的抗除草劑草甘膦基因，是轉(zhuǎn)基因植物研究中最為常用的一種篩選標記基因，因此本公司根據(jù)探針法 qPCR 原理開發(fā)了專門用于檢測口腔鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 根據(jù)口腔鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒保守區(qū)域設(shè)計引物和探針，能專一性地檢測出樣品中的口腔鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒成分，但不能檢測其他非口腔鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒成分。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 快速，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅為 2.0 小時。

6. 本只能用于科研，足夠 50 次 20uL 體系的探針法熒光定量 PCR。

PCR在分子和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟：

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl  

視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保溫7min。

3結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl氯仿進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

PCR實驗步驟

典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：

將待擴增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；

人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補結(jié)合，兩個引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴增片段的長短；

耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因為模板從5’→3’方向延伸，合成DNA的新互補鏈。

熒光化學(xué)物質(zhì)：

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：

1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的*技術(shù)平臺。

2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。

3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導(dǎo)致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

pBlueScriptR TTC 16pG5lac2 ug

pBlueScriptR TTC 18pG5-Luc2 ug

pBlueScriptR TTC21BpGAD4242 ug

pBMNpGAD53m2 ug

pBMN-IRES-GFPPgadt72 ug

pBMN-ZpGADT7Rec2 ug

pBNID-IdpGADT7-T2 ug

pBNID pGAG4242 ug

pBoBipGAPZ A2 ug

pBoBi-GFPpGAPZ B2 ug

pBpSTR1pGAPZ C2 ug

pBR322pGAPZα A2 ug

pBridgepGAPZα B2 ug

pBS185pGAPZα C2 ug

pBS-TpGAS-TA-Luc2 ug

水合酸鐵(> 99%,BR) 質(zhì)量規(guī)格：>98%,分子生物學(xué)級 Albumin, from bovine Protease free

水合紅菲繞啉二磺酸鈉水合物 質(zhì)量規(guī)格：AR Aluminum stearate

水飛薊素 質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR Bismuth(III) nitrate pentahydrate

水飛薊素 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR Calcium phosphate, dibasic, dihydrate

水飛薊賓(標準品) 質(zhì)量規(guī)格：>99.9%,AR Cerium(III) carbonate, hydrate

水飛薊賓 質(zhì)量規(guī)格：酶活：>1500 U/mg,BC Chymotrypsinogen A

霜霉威(分析標準品,99%) 質(zhì)量規(guī)格：ACS Grade Cibacron blue 3G-A

雙酸鈉 質(zhì)量規(guī)格：BR DEAE Dextran

雙香豆素（標準品） 質(zhì)量規(guī)格：>98%,植物激素級 Fluridone

雙水楊酯;水楊酸-2-羧基酯 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BC Histamine
口腔鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒檢測3-異倒捻子素對照品產(chǎn)品CAS：19275-46-8

規(guī)格含量：20mg

3-異倒捻子素對照品

英文名稱：3-isomangostin

別名：異倒捻子素

分子式：C24H26O6

分子量：410.463

CAS號：19275-46-8