產(chǎn)品及特點:

解沒食子酸鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒是從土壤農(nóng)桿菌 CP4 菌株中分離得到的抗除草劑草甘膦基因，是轉(zhuǎn)基因植物研究中最為常用的一種篩選標(biāo)記基因，因此本公司根據(jù)探針法 qPCR 原理開發(fā)了專門用于檢測解沒食子酸鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 根據(jù)解沒食子酸鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒保守區(qū)域設(shè)計引物和探針，能專一性地檢測出樣品中的解沒食子酸鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒成分，但不能檢測其他非解沒食子酸鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒成分。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 快速，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅為 2.0 小時。

6. 本只能用于科研，足夠 50 次 20uL 體系的探針法熒光定量 PCR。

PCR在分子和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟：

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl  

視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保溫7min。

3結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl氯仿進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

PCR實驗步驟

典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：

將待擴增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；

人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補結(jié)合，兩個引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴增片段的長短；

耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因為模板從5’→3’方向延伸，合成DNA的新互補鏈。

通用原則：

1， 先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近于探針。

2， 擴增子的長度應(yīng)不超過400bp，理想的*能在100－150bp內(nèi)，擴增片斷約短，有效的擴增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴增片斷也容易保證分析的一致性

3， 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會導(dǎo)致擴增效率的降低，及在SG分析中非特異信號。

4， 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G）

5， 將引物和探針互相進(jìn)行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。

b），探針設(shè)計指導(dǎo)

1，在設(shè)計引物之前設(shè)計探針

2，探針的Tm值應(yīng)在68－70℃之間，如果是目測探針，則要仔細(xì)審查GC富含區(qū)。

3，探針的5’端要避免有鳥氨酸，5’G會有淬滅作用，即使被切割下來這種淬滅作用也還會存在

4，選擇C多于G的鏈作探針，G的含量多于C會降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針。

6， 探針應(yīng)盡可能的短，不要超過30個bp。

7， 檢測探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)。

熒光化學(xué)物質(zhì)：

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：

1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的*技術(shù)平臺。

2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。

3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

土槿皮甲酸 中文別名：   土荊皮甲酸；土荊甲酸 英文名：   Pseudolaric acid A 英文別名：   (2E,4E)-5-[(3R,4S,4aS,9aR)-4a-(Acetyloxy)-3,4,4a,5,6,9-hexahydro-3,7-dimethyl-1-oxo-1H-4,9a-ethanocyclohepta[c]pyran-3-yl]-2-methyl-2,4-pentadienoic acid CAS登錄號：   82508-32-5 分子式：   C22H28O6 分子量：   388.46 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   白色晶體 規(guī)格：   20 mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測定/鑒定/藥理實驗等。 提取來源：   松科 植 物 金 錢 松 pseudolarix amabilis ( Nelsn ) Regd. [ p. kaempferi Gor d]的根皮 溶解性：   可溶于熱甲醇、吡啶、ＤＭＳＯ等溶劑。 熔點：   206-207℃ ：   、 、 抗生育。 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年

大豆皂苷Bb 中文別名：   大豆皂甙 BB 英文名：   Soyasaponin BB 英文別名：   Soyasaponin I CAS登錄號：   51330-27-9 分子式：   C48H78O18 分子量：   943.12 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   白色粉末 規(guī)格：   20 mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測定/鑒定/藥理實驗等。 提取來源：   豆科植物大豆Glycinemax(L.)merr種子 溶解性：   可溶于水、易溶于熱乙醇，難溶于*、苯等極性小的有機溶劑。 熔點：   224~ 226℃ ：   、 和，抗氧化 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年

單咖啡酰灑石酸 英文名：   2-Caffeoyl-L-tartaric acid 英文別名：   (2R,3R)-2-[[(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-oxo-2-propenyl]oxy]-3-hydroxybutanedioic acid CAS登錄號：   67879-58-7 分子式：   C13H12O9 分子量：   312.23 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   白色晶體 規(guī)格：   20 mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測定/鑒定/藥理實驗等。 提取來源：   菊科紫錐菊屬植物紫錐菊( E chinacea pur purea ( L . ) Moench) 溶解性：   可溶于甲醇、DMSO等溶劑。 熔點：   1123~ 125℃ ：   有、 、 、 和活性。 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年

二咖啡酰菊苣酸 英文名：   Cichoric acid 英文別名：   (2r,3r)-2,3-bis[[(e)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy]butanedioic acid CAS登錄號：   70831-56-0 分子式：   C22H18O12 分子量：   474.37 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   類白色結(jié)晶 規(guī)格：   20 mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測定/鑒定/藥理實驗等。 提取來源：   菊科植物菊苣（Cichorium intybus L） 溶解性：   可溶于甲醇、DMSO等溶劑。 ：   和作用。 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年

3,4,5-三咖啡酰奎寧酸 英文名：   3,4,5-Tricaffeoylquinic acid 英文別名：   (1alpha,3R,4alpha,5R)-3,4,5-Tris[[(2E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-oxo-2-propen-1-yl]oxy]-1-hydroxycy