1）RT-PCR可以檢測組織、細(xì)胞、血液、等很多材料，不同的樣本有不同要求，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)充分溝通確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實(shí)驗(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號(hào)；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，*通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括*定量和相對(duì)定量）和定性分析。

主要服務(wù)：DNA或RNA的*定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。

主要技術(shù)：引物設(shè)計(jì)、RNA提取、cDNA合成、qPCR

樣本采集、存放及運(yùn)輸：

1、樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

2、存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（zui多凍融3次）；

3、運(yùn)輸：采用泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

使用方法：

單增李斯特菌PCR檢測試劑盒注：所有試劑使用前需完全解凍，混合均勻，6,000rpm離心數(shù)秒后使用。

1.樣本處理（樣本處理區(qū)）

待檢樣本的核酸提取可采用RNA提取試劑盒或自動(dòng)化核酸提取儀等，具體提取方法請(qǐng)參照相關(guān)說明書；陽性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品無需提取，可直接使用。

2. 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（PCR前準(zhǔn)備區(qū)）

取N個(gè)（N=陰性質(zhì)控品+待檢樣本+陽性質(zhì)控品）PCR反應(yīng)管，每管分別加入FMD RT-PCR反應(yīng)液19μl、RT-PCR酶1 μl (也可根據(jù)每頭份用量計(jì)算N+1份FMD RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶所需總量，兩者混勻離心后分裝20 μl至單個(gè)PCR反應(yīng)管)。

組分每頭份用量FMD  RT-PCR反應(yīng)液19 μlRT-PCR酶。

1 .將所有PCR反應(yīng)管于6,000rpm離心30s，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

2.加樣（樣本處理區(qū)）

3.在上述的PCR反應(yīng)管中分別加入待檢樣本RNA提取物、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品各5 μl，蓋緊管蓋，于6,000rpm離心10s，轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。

PCR反應(yīng)五要素：

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

⑤引物3’端的堿基，特別是zui末及倒數(shù)*個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列zui有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子*很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

單增李斯特菌PCR檢測試劑盒

蕓香葉苷

大鼠補(bǔ)體片斷*(C*)

磷脂酶D

苯甲氧羰酰琥珀酰亞胺

人低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(LRP-6)

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶測試盒

大鼠內(nèi)皮素1(ET-1)

人遲現(xiàn)抗原4(VLA4) 

雞弓形蟲循環(huán)抗原(TCA)

葡萄糖脫氫酶（GCDH)測試盒

人血管緊張肽酶A(ATA) 

豚鼠γ干擾素(IFN-γ)

蝶蛹金小蜂卵黃蛋白原（vtg)

磷脂酰絲氨酸

FMOC-L-苯丙氨酸

ADP含量測試盒

D-脯氨酰胺

亞甲基藍(lán)

S-羧甲基-L-半胱氨酸

2′-脫氧肌苷-5′-單磷酸二鈉鹽

人C4結(jié)合蛋白(C4BP)

人鳥氨酸脫羧酶(ODC)

人毒蕈堿型乙酰膽堿受體(M-AChR) 

大鼠促腎上皮質(zhì)釋放(CRH)

谷氨酸脫羧酶（GAD）測試盒

甲基紫

人抗髓磷脂抗體IgA(AMA IgA) 

人吖啶橙(AO)

土壤全鐵測試盒

α-酮基異己酸鈣鹽

5-鳥苷一磷酸二鈉鹽

5-胞苷一磷酸二鈉鹽

雞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH) 

豬血管生成素受體/含免疫球蛋白樣環(huán)和上皮生長因子樣域酪氨酸激酶2(Tie-2)

干酪素鈉

土壤全磷含量測定

人蛋白酶3抗體(PR3Ab)

檸檬酸鈣四水物

人乙型肝炎X蛋白相互作用蛋白(HBXIP)

雞傳染性鼻炎抗體(IC)

2′-疊氮脫氧尿苷

還原輔酶Ⅱ四鈉鹽水合物

兔子基質(zhì)金屬蛋白酶因子1(TIMP-1)

兔子β血小板球蛋白/β血栓環(huán)蛋白(β-TG)

3-磷酸甘油酸激酶(PGK)測試盒

核固紅

大鼠睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)

Hotstart Taq酶

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/NADH-輔酶Q還原酶測試盒   

土壤纖維素酶（S-CL）/羧甲基纖維素酶測試盒

人白介素17(IL-17)

甲基紅

人Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)

N-芴甲氧羰基-N'-甲苯磺?；?L-精氨酸

維生素A

人抗突觸前膜抗體(PsmAb)