產(chǎn)品及特點(diǎn):

偽狂犬病病毒探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒是從土壤農(nóng)桿菌 CP4 菌株中分離得到的抗除草劑草甘膦基因，是轉(zhuǎn)基因植物研究中最為常用的一種篩選標(biāo)記基因，因此本公司根據(jù)探針?lè)?qPCR 原理開發(fā)了專門用于檢測(cè)偽狂犬病病毒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 根據(jù)偽狂犬病病毒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，能專一性地檢測(cè)出樣品中的偽狂犬病病毒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒成分，但不能檢測(cè)其他非偽狂犬病病毒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒成分。

3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 快速，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程（按一個(gè)樣品計(jì)）所需時(shí)間僅為 2.0 小時(shí)。

6. 本只能用于科研，足夠 50 次 20uL 體系的探針?lè)晒舛?PCR。

PCR在分子和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl  

視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保溫7min。

3結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl氯仿進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

PCR實(shí)驗(yàn)步驟

典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過(guò)多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：

將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；

人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短；

耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙?’→3’方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。

通用原則：

1， 先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近于探針。

2， 擴(kuò)增子的長(zhǎng)度應(yīng)不超過(guò)400bp，理想的*能在100－150bp內(nèi)，擴(kuò)增片斷約短，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片斷也容易保證分析的一致性

3， 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低，及在SG分析中非特異信號(hào)。

4， 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G）

5， 將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。

b），探針設(shè)計(jì)指導(dǎo)

1，在設(shè)計(jì)引物之前設(shè)計(jì)探針

2，探針的Tm值應(yīng)在68－70℃之間，如果是目測(cè)探針，則要仔細(xì)審查GC富含區(qū)。

3，探針的5’端要避免有鳥氨酸，5’G會(huì)有淬滅作用，即使被切割下來(lái)這種淬滅作用也還會(huì)存在

4，選擇C多于G的鏈作探針，G的含量多于C會(huì)降低反應(yīng)效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針。

6， 探針應(yīng)盡可能的短，不要超過(guò)30個(gè)bp。

7， 檢測(cè)探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)。

熒光化學(xué)物質(zhì)：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下：

1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的*技術(shù)平臺(tái)。

2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。

3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過(guò)程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：

簡(jiǎn)介：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。

1、熒光定量PCR服務(wù)要求：

（01）請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。

（02）請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列。

（03）請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來(lái)源等

2、熒光定量PCR操作程序

（01）引物（探針）設(shè)計(jì)與合成。

（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。

（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料。

3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：

  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。

H-89 . 2HCL（PKA抑制劑）Growth Factor For Cell Culture1mg

H-89（PKA抑制劑）Growth Factor For Cell Culture1mg

HDAC抑制劑Growth Factor For Cell Culture1mg

Hemoglobin（NO清除劑）Growth Factor For Cell Culture1mg

InsulinGrowth Factor For Cell Culture1mg

Ionomycin（鈣離子載體）Growth Factor For Cell Culture1mL

KT5823（PKG抑制劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

L-Arginine（NO前體）Growth Factor For Cell Culture1mL

L-Canavanine（iNOS抑制劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

L-Citrulline（NO中間體）Growth Factor For Cell Culture1mL

Leptomycin B（出核）Growth Factor For Cell Culture1mL

L-Glutathione (reduced form)(抗氧化劑)Growth Factor For Cell Culture1mL

Lipoic acid（抗氧化劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

L-NAME（eNOS抑制劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

L-NMMA（總NOS抑制劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

鹽酸哌維林（標(biāo)準(zhǔn)品） 質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR Prazosin HCl

鹽酸帕他莫(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：>97%,USP,BR Prednisolone acetate

鹽酸帕他莫 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR Prednisone Acetate

鹽酸美卡因 質(zhì)量規(guī)格：HPLC>98%,標(biāo)準(zhǔn)品 Prednisone Acetate

鹽酸卡特羅（標(biāo)準(zhǔn)品） 質(zhì)量規(guī)格：>99%,S構(gòu)型 Pregabalin

"0.水250g用于制備藥品樣品的稀釋液或沖洗液

瓊脂 250(g) incubation media 瓊脂 250(g)

克雷伯氏顯色培養(yǎng)基 克雷伯氏顯色培養(yǎng)基 250克 克雷伯氏菌快速顯色分離培養(yǎng)

氯化三四氮唑-沙保羅培養(yǎng)基250用于分離真菌，酵母菌等incubationmedia氯化三四氮唑-沙保羅培養(yǎng)基250用于分離真菌，酵母菌等

胰酪胨大豆羊血瓊脂基礎(chǔ) 250g 用于蠟樣芽孢桿菌的溶血測(cè)試驗(yàn)

NCI-H838(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 A9(皮下結(jié)締組織細(xì)胞)

CL-0313293FT(人胚腎細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

SPINK4 Others Mouse 小鼠 SPINK4 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) 

C2C12小鼠成肌細(xì)胞 C2C12 mouse myoblasts DMEM+10%FBS

IL36A Protein Mouse 重組小鼠 IL-1F6 / IL-1 epsilon 蛋白

小鼠氣管和支氣管上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mL

 Gentamicin 1403-66-3 質(zhì)量規(guī)格：效價(jià)測(cè)定

 Rifamycin Sodium 14897-39-3 質(zhì)量規(guī)格：效價(jià)測(cè)定

 SL-327 305350-87-2 質(zhì)量規(guī)格：>98%，MEK1/2抑制劑

 Midecamycin 35457-80-8 質(zhì)量規(guī)格：效價(jià)測(cè)定

 Tobramycin Base 32986-56-4 質(zhì)量規(guī)格：效價(jià)測(cè)定

 Nystatin 1400-61-9 質(zhì)量規(guī)格：效價(jià)測(cè)定

 SULBENICILLIN 41744-40-5 質(zhì)量規(guī)格：效價(jià)測(cè)定

 Acetylspiramycin 24916-51-6 質(zhì)量規(guī)格：效價(jià)測(cè)定

 Potassium trichloroammineplatinate(II) 13820-91-2 質(zhì)量規(guī)格：>95%

 Sisomicin 32385-11-8 質(zhì)量規(guī)格：效價(jià)測(cè)定

 spectinomycin 1695-77-8 質(zhì)量規(guī)格：效價(jià)測(cè)定

 5-MTHF；5-Methyltetrahydrofolic Acid Calcium Salt Trihydrate 134-35-0 (free acid) 質(zhì)量規(guī)格：進(jìn)口，鈣鹽三水合物

 Kitasamycin 1392-21-8 質(zhì)量規(guī)格：效價(jià)測(cè)定

 josamycin 16846-24-5 質(zhì)量