豌豆耳狀突起花葉病毒RT-PCR試劑盒PCR定量檢測

特別提示：包括豌豆耳狀突起花葉病毒RT-PCR試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：豌豆耳狀突起花葉病毒RT-PCR試劑盒

英文名稱：Pea Enation Mosaic Virus(PEMV

產(chǎn)品規(guī)格：50次

產(chǎn)品保存：-20℃保存

產(chǎn)品有效期：一年

儲存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。

運輸：低溫、避光，快遞免費送貨上門。

豌豆耳狀突起花葉病毒RT-PCR試劑盒產(chǎn)品及特點: 

因此快速靈敏檢測豌豆耳狀突起花葉病毒RT-具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 引物經(jīng)過精心優(yōu)化，專一性強，只擴增豌豆耳狀突起花葉病毒RT-，與其他植物沒有交叉反應(yīng)。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳。

5. 本試劑盒足夠做 40μL 體系的 PCR 50 次，但只能用于科研。

豌豆耳狀突起花葉病毒RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分:

運輸及保存：低溫運輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽性對照需要單獨放置，不要污染其他試劑。

自備試劑：樣品 DNA。

豌豆耳狀突起花葉病毒RT-PCR試劑盒使用方法：

 一、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。本試劑盒免費贈送20 次核酸釋放劑試用裝，其使用手冊可以從本公司網(wǎng)站訂購核酸釋放劑。

2. 如果有 N 個樣品，則需要做 N+2 個提取，包括一個樣品制備陽性對照和一個樣品制備陰性對照。樣品制備陽性對照是在適量水（取決于試劑盒要求的樣品起始量）中加 10μL 豌豆耳狀突起花葉病毒RT- PCR 陽性對照的 1000 倍稀釋液而得，樣品制備陰性對照是直接用水。提取結(jié)束后最后得到模板 DNA 放冰上待用。

二、設(shè)置 PCR 反應(yīng)（40μL 體系）

3. 對 N+2 個樣品，在 PCR 時需要增加一個 PCR 陽性對照和一個 PCR 陰性對照，故需要設(shè)置 N+4 個反應(yīng)。在 N+4 個 PCR 管中分別加入下列成分：

4. 按下表設(shè)置 PCR 反應(yīng)：

三、電泳檢測

5. 取 10-20 μL PCR 產(chǎn)物。電泳檢測 PCR 產(chǎn)物。本產(chǎn)品提供的 PCR Mix在擴增結(jié)束后可以直接上樣，不需要另外再加 loading buffer。PCR 產(chǎn)物陽性對照必須有預(yù)期條帶出現(xiàn)，陰性對照必須無任何擴增，否則實驗無效。對沒有擴增產(chǎn)物的樣品，可以稀釋 10 倍后重復(fù) PCR 擴增以排除 PCR 抑制劑的感染。

PCR常見問題的常見原因

1. cDNA產(chǎn)量的很低可能的原因：

1) RNA模板質(zhì)量低

2) 對mRNA濃度估計過高

3) 反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足

4) 同位素磷32過期

5) 反應(yīng)體積過大，不應(yīng)超過50μl

2. 擴增產(chǎn)物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺

1) 最常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系

3) 與反應(yīng)起始時RNA的總量及純度有關(guān)

4) 建議在試驗中加入對照RNA

5) 第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴增時，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過1/10

6) 建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進(jìn)行有效延伸。

7) 目的mRNA中含有強的轉(zhuǎn)錄中止位點，可以試用以下方法解決：

a. 將第一鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。

b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行第一鏈反應(yīng)。

3. 產(chǎn)生非特異性條帶

1) 用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

2) 在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。

3) 由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。

4. 產(chǎn)生彌散（smear）條帶

1) 在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過高

2) 減少引物的用量

3) 優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)

4) 在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會產(chǎn)生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。

5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶

1) 大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的

2) 對于長片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）

6. 在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結(jié)果