壞死梭桿菌RT-PCR試劑盒PCR定量檢測

特別提示：包括壞死梭桿菌RT-PCR試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產品名稱：壞死梭桿菌RT-PCR試劑盒

英文名稱：Fusobacterium necrophorum

產品規(guī)格：50次

產品保存：-20℃保存

產品有效期：一年

儲存條件：-20℃避光保存，避免反復凍融。

運輸：低溫、避光，快遞免費送貨上門。

壞死梭桿菌RT-PCR試劑盒產品及特點: 

因此快速靈敏檢測壞死梭桿菌RT-具有重要意義。本產品就是為此目的根據 PCR 原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 引物經過精心優(yōu)化，專一性強，只擴增壞死梭桿菌RT-，與其他植物沒有交叉反應。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳。

5. 本試劑盒足夠做 40μL 體系的 PCR 50 次，但只能用于科研。

壞死梭桿菌RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分:

運輸及保存：低溫運輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽性對照需要單獨放置，不要污染其他試劑。

自備試劑：樣品 DNA。

壞死梭桿菌RT-PCR試劑盒使用方法：

 一、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數核酸提取試劑盒兼容。本試劑盒免費贈送20 次核酸釋放劑試用裝，其使用手冊可以從本公司網站訂購核酸釋放劑。

2. 如果有 N 個樣品，則需要做 N+2 個提取，包括一個樣品制備陽性對照和一個樣品制備陰性對照。樣品制備陽性對照是在適量水（取決于試劑盒要求的樣品起始量）中加 10μL 壞死梭桿菌RT- PCR 陽性對照的 1000 倍稀釋液而得，樣品制備陰性對照是直接用水。提取結束后最后得到模板 DNA 放冰上待用。

二、設置 PCR 反應（40μL 體系）

3. 對 N+2 個樣品，在 PCR 時需要增加一個 PCR 陽性對照和一個 PCR 陰性對照，故需要設置 N+4 個反應。在 N+4 個 PCR 管中分別加入下列成分：

4. 按下表設置 PCR 反應：

三、電泳檢測

5. 取 10-20 μL PCR 產物。電泳檢測 PCR 產物。本產品提供的 PCR Mix在擴增結束后可以直接上樣，不需要另外再加 loading buffer。PCR 產物陽性對照必須有預期條帶出現(xiàn)，陰性對照必須無任何擴增，否則實驗無效。對沒有擴增產物的樣品，可以稀釋 10 倍后重復 PCR 擴增以排除 PCR 抑制劑的感染。

PCR常見問題的常見原因

1. cDNA產量的很低可能的原因：

1) RNA模板質量低

2) 對mRNA濃度估計過高

3) 反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足

4) 同位素磷32過期

5) 反應體積過大，不應超過50μl

2. 擴增產物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺

1) 最常見的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系

3) 與反應起始時RNA的總量及純度有關

4) 建議在試驗中加入對照RNA

5) 第一鏈的反應產物在進行PCR擴增時，在總的反應體系中的含量不要超過1/10

6) 建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級結構，如環(huán)狀結果，有可能導致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反轉錄酶無法從此引物進行有效延伸。

7) 目的mRNA中含有強的轉錄中止位點，可以試用以下方法解決：

a. 將第一鏈的反應溫度提高至50℃。

b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進行第一鏈反應。

3. 產生非特異性條帶

1) 用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

2) 在PCR反應中，非特異的起始擴增將導致產生非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產生。

3) 由于mRNA剪切方式的不同，根據選擇引物的不同將導致產生不同的RT-PCR結果。

4. 產生彌散（smear）條帶

1) 在PCR反應體系中第一鏈產物的含量過高

2) 減少引物的用量

3) 優(yōu)化PCR反應條件/減少PCR的循環(huán)次數

4) 在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產生的寡核苷酸片段會產生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。

5. 產生大分子量的彌散條帶

1) 大多數情況下是由于退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產生的

2) 對于長片段的PCR，建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）

6. 在無反轉錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結果