技術(shù)原理:

DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。

在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。（ DNA高溫變性低溫復(fù)性）

發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。

使用及效果：

將壓碎的一小片重量約在100 mg 左右的植物種子（約1/4 黃豆大小）或直徑約為0.5-0.7 cm（或面積相當(dāng)?shù)钠渌螤睿┑闹参锶~片直接加到新鮮配制的0.1 mL溶液A 中，95℃保溫10-15 分鐘，加入0.1 mL 溶液B，混勻，直接取上清液（相當(dāng)于PCR 體積的1/10）作為模板進(jìn)行PCR。剩余樣品可以放4℃保存。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

1）RT-PCR可以檢測(cè)組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)充分溝通確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實(shí)驗(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號(hào)；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，*通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括*定量和相對(duì)定量）和定性分析。

主要服務(wù)：DNA或RNA的*定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。

主要技術(shù)：引物設(shè)計(jì)、RNA提取、cDNA合成、qPCR

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②堿基配對(duì)原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

(2) 靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中zui小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。

(3) 簡(jiǎn)便、快速

PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

(4) 對(duì)標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。

乳粉中霉菌和酵母計(jì)數(shù) 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件RuBiSCo啟動(dòng)子LAMP試劑盒

乳粉中乳酸菌計(jì)數(shù)（雙歧桿菌計(jì)數(shù)） 50g 轉(zhuǎn)基因元件RuBiSCo啟動(dòng)子PCR試劑盒

凍干粉中腸道出血性大腸埃希氏菌（陽性） 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件RuBiSCo啟動(dòng)子染料法qPCR試劑盒

乳粉中蠟樣芽胞桿菌（定量） 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件RuBiSCo啟動(dòng)子探針法qPCR試劑盒

凍干粉中霉菌和酵母計(jì)數(shù) 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件SSU啟動(dòng)子LAMP試劑盒

乳粉中克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）（陽性） 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件SSU啟動(dòng)子PCR試劑盒

凍干粉中克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）（陽性） 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件SSU啟動(dòng)子染料法qPCR試劑盒

乳粉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（陽性） 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件SSU啟動(dòng)子探針法qPCR試劑盒

凍干粉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（陽性） 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件tE9 LAMP試劑盒

凍干粉中副溶血性弧菌（陽性） 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件tE9 PCR試劑盒

凍干粉中志賀氏菌（陽性） 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件tE9染料法熒光定量PCR試劑盒

乳粉中沙門氏菌（陽性） 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件tE9探針法熒光定量PCR試劑盒

凍干粉中沙門氏菌（陽性） 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件tg7 LAMP試劑盒

乳粉中金黃色葡萄球菌（定量） 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件tg7 PCR試劑盒

凍干粉中金黃色葡萄球菌（定量） 真空西林瓶 轉(zhuǎn)基因元件tg7染料法熒光定量PCR試劑盒
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