準(zhǔn)備物品：

清理液（A）                                   毫升

染色液（t B）                                   微升

稀釋液（C）                                   毫升

溶解液（tD）                                   毫升

產(chǎn)品說明書                                   1份

普通PCR反應(yīng)流程：

組成及試劑配制:

1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。

反應(yīng)五要素：

豬嵴病毒庫布病毒PCR檢測(cè)試劑盒參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列*有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子*很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

使用方法 ：   

1 實(shí)驗(yàn)所需器材與試劑

1.1 器材

1）PCR儀

2）PCR反應(yīng)管

3）電泳儀及水平電泳槽

4）高速離心機(jī)

5）微量移液器及移液器吸頭

1.2 試劑

1）瓊脂糖

2）EB（溴化乙錠）

3）去離子水或雙蒸水

注意事項(xiàng)：   

5.1使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說明書全文。

5.2 操作時(shí)應(yīng)盡量少說話，因口腔中也含有支原體，可能引起樣品污染，而造成假陽性；整個(gè)檢測(cè)過程中，反應(yīng)體系的配制、樣本處理及加樣、PCR擴(kuò)增應(yīng)分區(qū)域進(jìn)行，以避免交叉污染。 5.3 實(shí)驗(yàn)時(shí)，試劑盒組分中的試劑使用前應(yīng)充分融化并混勻（混勻時(shí)禁止激烈振蕩，只需要進(jìn)行上下倒置多次進(jìn)行混勻）。

5.4 反應(yīng)管中加好所有的試劑后，應(yīng)盡快上PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以免形成過多的二聚體。

5.5細(xì)胞培養(yǎng)物中含有青霉素和鏈霉素等抗生物素不會(huì)影響本品的檢測(cè)結(jié)果。如果用戶需要進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，建議細(xì)胞在不含青霉素和鏈霉鏈等抗生素中進(jìn)行培養(yǎng)2-3天后送樣檢測(cè)。

24-澤瀉A;Alisol A 2 訂購|咨詢 PI ELISA Kit  大鼠胰島素 規(guī)格： 20mg

愈創(chuàng)木;Guaiacol 訂購|咨詢 大鼠抗IgE受體抗體ELISA Kit  大鼠抗IgE受體抗體 規(guī)格： 20mg

葉綠;Phytol 訂購|咨詢 AACT(Human Alpha1 Antichymotrypsin) ELISA Kit  人α1抗胰糜蛋白酶 規(guī)格： 20mg

藥根堿;Jatrorrhizine 訂購|咨詢 GMP-140(Mouse alpha-granular membrane protein) ELISA Kit  小鼠血漿α顆粒膜蛋白 規(guī)格： 20mg

遠(yuǎn)志;Polygalacic acid 訂購|咨詢 SP-A(Human Pulmonary surfatcant-associated protein A) ELISA Kit  人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A 規(guī)格： 20mg

夏佛塔苷;Schaftoside 訂購|咨詢 MPO(Mouse myeloperoxidase) ELISA Kit  小鼠髓過氧物酶 規(guī)格： 20mg

維生素C;Vitamin C 訂購|咨詢 大鼠抗IVIgG抗體ELISA Kit  大鼠抗IVIgG抗體 規(guī)格： 100mg

通關(guān)藤苷H;Tenacissoside 訂購|咨詢 Gzms-B(Mouse granzymes B) ELISA Kit  小鼠顆粒酶B 規(guī)格： 20mg

L-絲;L-Serine 訂購|咨詢 HP-CagA-IgG(Human Helicobacter pylori cytotoxin-associated gene A protein IgG) ELISA Kit  人幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因蛋白A-IgG 規(guī)格： 100mg

鼠尾草;Carsic acid 訂購|咨詢 P53 ELISA Kit  大鼠P53 規(guī)格： 20mg

升素;Cimifugin 訂購|咨詢 MUC7(Human Mucin-7) ELISA Kit  人粘蛋白/粘液素7 規(guī)格： 20mg

人參皂苷Rg3;Ginseside 訂購|咨詢 cGMP ELISA Kit  大鼠環(huán)磷鳥苷 規(guī)格： 20mg

13-去羥基印烏堿 ; 13-Dehyd 訂購|咨詢 VEGFR-1/Flt1(Mouse Vascuoar endothelial cell growth factor receptor 1) ELISA Kit  小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1 規(guī)格： 20mg

羥基芍藥苷;oxypaeoniflori 訂購|咨詢 Y-GT(Rat) ELISA Kit  大鼠Y-谷酰轉(zhuǎn)肽酶 規(guī)格： 20mg

?；蛆Z去氧膽 ;Tauroched 訂購|咨詢 NOS ELISA Kit  大鼠一氧氮合成酶 規(guī)格： 20mg

綿馬ABA;Filixic acid 訂購|咨詢 Gzms-A(Mouse granzymes A) ELISA Kit  小鼠顆粒酶A 規(guī)格： 20mg

羅漢果苷III;Mogroside II 訂購|咨詢 Lptn/LTN/XCL1(Mouse lymphotactin) ELISA Kit  小鼠淋巴細(xì)胞趨因子 規(guī)格： 10mg

軟骨素;Chondroitin 4- 訂購|咨詢 iNOS ELISA KIT   大鼠誘導(dǎo)型一氧氮合成酶 規(guī)格： 30mg
豬嵴病毒庫布病毒PCR檢測(cè)試劑盒

"英文名稱：adenovirus expressing mCherry-GFP-LC3B fusion protein

產(chǎn)品規(guī)格：1ml|10×1ml

發(fā)貨周期：1～3天

本品是一種可以表達(dá)mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒，可以用于感染細(xì)胞或組織后進(jìn)行細(xì)胞自噬的檢測(cè)。

LC3是酵母自噬關(guān)鍵蛋白ATG8在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白。LC3最初被分析鑒定為microtubule-associated protein 1 light chain 3。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亞家族，其中對(duì)于LC3B的研究最為廣泛。到目前為止，LC3B被認(rèn)為是細(xì)胞自噬信號(hào)通路最為關(guān)鍵的標(biāo)志性蛋白。LC3B是一個(gè)具有125個(gè)氨基酸殘基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22個(gè)氨基酸蛋白，從而暴露出C端的甘氨酸，人們把它命名為胞質(zhì)形式的LC3B I。在細(xì)胞自噬的過程中，其C端暴露的甘氨酸經(jīng)過一個(gè)類似泛素化的過程，以ATG7為E1樣激活酶， 以ATG3為E2樣連接酶，以Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物為E3樣連接酶，在C端甘氨酸上共價(jià)連接上磷脂酰(phosphatidylethanolamine,PE)而成為L(zhǎng)C3B-PE即LC3B II。與胞質(zhì)定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬體的內(nèi)膜和外膜上。在自噬體與溶酶體融合后，自噬體外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬體內(nèi)膜上的LC3B II則被溶酶體內(nèi)的蛋白酶所降解。盡管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其極強(qiáng)的疏水性，在SDS-PAGE電泳時(shí)，LC3B II比LC3B I遷移得更快，其表觀分子量分別為14kD和16kD。在用GFP-LC3B腺病毒感染細(xì)胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B以彌散的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來。

自噬是一種在進(jìn)化上高度保守的通過溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關(guān)，在饑餓等不利的環(huán)境條件下， 細(xì)胞通過自噬降解多余或異常的細(xì)胞內(nèi)組分，為細(xì)胞的生存提供能量及原材料，促進(jìn)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化及對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生應(yīng)答。自噬異常與多種病理過程如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關(guān)系。由于細(xì)胞自噬在生理和病理過程中都有重要作用，自噬已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。

Ad-mCherry-GFP-LC3B是的重組腺病毒，感染后能夠在靶細(xì)胞中有效表達(dá)紅色熒光蛋白mCherry、綠色熒光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈現(xiàn)明亮的紅色和綠色熒光，可以用于細(xì)胞自噬的檢測(cè)。

自噬小體在與溶酶體融合過程中，溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境會(huì)導(dǎo)致GFP熒光淬滅，這為追蹤GFP-LC3B的細(xì)胞定位增加了難度。mCherry是一種來自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的單體紅色熒光蛋白，當(dāng)其與GFP進(jìn)行LC3B的共同標(biāo)記時(shí)，在GFP被溶酶體酸性環(huán)境所淬滅的情況下，可以發(fā)出紅色熒光的mCherry因?yàn)槠?的穩(wěn)定性而被保留。因此，通過融合表達(dá)mCherry-GFP-LC3B蛋白，可以非常有效地追蹤自噬過程。在用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染細(xì)胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下mCherry-GFP-LC3B以彌散的黃色熒光(mCherry和GFP的綜合效果)形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下mCherry-GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以黃色斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來(LC3B dot or punctae)；當(dāng)自噬體與溶酶體融合后，因GFP熒光的部分淬滅而以紅色斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來。

腺病毒感染細(xì)胞后為瞬時(shí)表達(dá)，通常不會(huì)與基因組DNA重組，不能用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞株